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两种猪肠道冠状病毒诊断方法的建立和国内新分离毒株主要结构蛋白基因克隆与序列分析

杨群

  猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是引起仔猪腹泻的两大主要病毒,临床症状流行特点十分相似,但没有共同的抗原性。根据GenBank上已发表的PEDV和TGEV基因序列,针对其PEDV M基因(膜蛋白基因)保守区及TGEV的S基因(纤突蛋白基因)5’端保守区,各设计一对引物,可特异扩增出长为467bp和1062bp的目的条带,建立了一种多重RT-PCR方法同时检测猪的这两种肠道冠状病毒:PEDV和TGEV。用上述方法可对同一样品中的PEDV和TGEV可进行鉴别检测,对猪的其它病毒和细菌的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该双重PCR方法能检出PEDV1pg、TGEV0.1pg的模板。同时采用建立的多重RT-PCR与韩国引进的PEDV和TGEV病毒抗原快速诊断试剂盒检测结果显示:此多重RT-PCR法特异性强,且较快速试剂盒更加敏感。应用建立的多重RT-PCR方法对158份临床猪粪样的检测结果表明:我国很多猪场普遍存在TGEV和PEDV,尤其以PEDV污染更为严重,感染率达53.2%,但双重感染率较低,仅为4.4%。根据GenBank中已发表的PEDV、TGEV主要结构蛋白基因cDNA序列设计合成12对引物,对国内新分离毒株PEDV JS-2004-2、PEDV AH-2004和TGEV HN2002、TGEV JS-2004进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),分别扩增出两种病毒的S1、S2、S3、S4、M和N六个基因片段,PEDV六个片段的长度依次是1319bp、1322bp、1463bp、1193bp、917bp和1436bp;TGEV六个片段的长度依次为1117bp、1039bp、1459bp、1311bp、875bp和1296bp。将它们分别进行T/A克隆、测序并拼接成完整的基因序列。比较其与其它相应毒株核苷酸及编码氨基酸的同源性,发现TGEV HN2002和JS-2004株与国内的TS株亲缘关系相对最近,与英国的96~1933株亲缘关系相对较远;PEDVJS-2004-2株,AH-2004株和CV777株的同源性很高,S、M、N序列同源性皆在95%以上,其中JS-2004-2株和AH-2004株亲缘关系相对较近。猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S蛋白)是诱导中和抗体产生的主要蛋白。通过RT-PCR扩增其S蛋白抗原性较好的部分基因片段的cDNA,将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET-32a中;用此重组质粒pET-32a/TGEV-S转化大肠杆菌Rosetta菌株,在浓度为1mMIPTG和28℃条件下诱导表达;经SDS-PAGE及免疫转印鉴定结果显示:重组蛋白具有免疫原性。……   
[关键词]:猪流行性腹泻病毒(PEDV);猪传染性胃肠炎病毒(TGEV);多重PCR;结构蛋白;克隆;序列分析;表达;间接ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2005年