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野油菜黄单胞菌α-淀粉酶性质及其体外定向进化研究

陈红歌

  本文以α-淀粉酶体外定向进化为主线,从α-淀粉酶基因克隆、体外随机诱变、DNA改组、酶结构与功能关系、突变酶性质等方面进行了较为系统的研究,取得了目前国内α-淀粉酶基础研究领域较为丰富的研究成果。研究了野油菜黄单胞菌8004菌株的α-淀粉酶性质,克隆了与酶相对应的基因,同时也克隆了枯草芽孢杆菌As1.108的α-淀粉酶基因——通过酶定位试验证实野油菜黄单胞菌8004仅产生一型α-淀粉酶,是胞外分泌型的,它的最适作用温度为50℃,最适pH为6.2,其温度稳定性较差,60℃保温30min后酶活力已基本丧失,但在pH4.86-10.47的较宽的pH范围内稳定,SDS-PAGE测定其分子量为50kDa。采用鸟枪法顺利地克隆了该酶的基因,NCBI收录号为AF482991,基因编码区全长1425bp,舍有典型的不同来源α-淀粉酶共有的四个保守区序列。由DNA推定的α-淀粉酶前体由475个氨基酸组成,N-端有35个氨基酸组成的信号肽,因而成熟酶由440个氨基酸组成,其大小与实测的α-淀粉酶相当。同样用鸟枪法克隆到枯草杆菌α-淀粉酶基因,NCBI收录号为AY376455,该α-淀粉酶基因的编码区全长1947bp,由DNA推测的α-淀粉酶前体由649个氨基酸组成,N-端33个氨基酸为信号肽序列,成熟酶由616个氨基酸组成,估算分子量为67kDa。建立了PCR体系中5-溴脱氧尿苷三磷酸部分取代脱氧胸苷三磷酸的基因体外诱变新方法,并得到野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因的高酶活突变体——5-溴脱氧尿苷三磷酸是脱氧胸苷三磷酸的类似物,将它以不同比例代替脱氧胸苷三磷酸参入到PCR体系中,实验证明0.1%的5-BrdUTP取代比例是进行体外诱变的最适比例,有利于筛选到高酶活的α-淀粉酶突变基因,过高的比例则产生过多的失活基因,比例太小又不足以形成一定的突变体库。实验还证明它不仅能引起碱基置换,还能引起碱基的缺失和添加,并使突变在整个基因片断的随机部位发生,因而是一种简便、有效的基因体外诱变方法。采用0.1%的5-BrdUTP取代比例诱变野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因,经过2轮诱变和筛选,获得一高酶活突变体pHNH003,其酶活力约是野生基因的10倍,序列分析发现自390位氨基酸处开始发生移码,使C末端氨基酸序列完全不同于……   
[关键词]:野油菜黄单胞菌;α-淀粉酶;定向进化;比活力;三维结构
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2005年