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牦牛血红蛋白的基因克隆和同源模建

袁青妍

  世界牦牛起源于中国,全世界牦牛数量的95%分布在中国。现代的家养牦牛是中国古羌人(即现代藏族人的祖先)在距今大约5000-10000年左右的旧石器时代驯化野牦牛而来的。它们主要分布在海拔3000m以上的寒冷、低氧地区,那里的空气氧含量只为海平面的1/3~1/2。牦牛长期生活在这种寒冷、低氧环境下,不仅能正常繁育后代,而且能为藏族人民提供奶、肉、皮、毛、绒等生活必需品,素有“高原之舟”的美称。它不仅血红蛋白含量高,而且血红蛋白的氧亲和力也高。Lalthantluanga及Weber等人认为牦牛血红蛋白氧亲和力高主要是由于其β_Ⅱ链第135位的缬氨酸代替丙氨酸所致。他们只是从一级结构上预测,没有进一步从高级结构上进行阐明。血红蛋白主要在血液中起传送O_2及CO_2的作用,它在牦牛适应高原低氧中起着重要的作用。我们首先克隆测定牦牛珠蛋白基因的核苷酸序列,然后从数据库中调出牦牛血红蛋白α_Ⅰ及B_Ⅱ珠蛋白链的氨基酸序列,运用分子模拟软件InsightⅡ来同源建牦牛血红蛋白的四级结构,以期揭示牦牛血红蛋白高氧亲和力的分子基础与结构基础。我们利用山羊、人及黄牛中α珠蛋白基因的保守序列设计引物来扩增牦牛的α珠蛋白基因,结果得到一条长度为754bp的片段。经鉴定所测序列为牦牛α_1珠蛋白基因。它与黄牛的同源性最高,为99.71%,水牛次之,为98.58%,而与山羊、绵羊、马、人的同源性较差,分别为96.03%、95.57%、68.55%、51.13%。以所测序列设计引物来扩增两个内含子,结果两个内含子都只扩增到一条片段。运用起始密码子及终止密码子附近的序列设计引物扩增牦牛α珠蛋白基因间区域,结果得到一条2470bp的片段。将它进行同源性搜索,发现没有一个基因与它同源,也即此区域内不存在任何基因。为了鉴定两个α珠蛋白基因在染色体上的排列顺序,重新设计了两对引物来分别扩增上游基因及下游基因。结果上游基因扩到一条1086bp的片段,而下游基因也扩到一条1140bp的片段。上游基因克隆测序鉴定后为α_1珠蛋白基因,下游基因克隆测序鉴定后为α_2珠蛋白基因。以上研究表明牦牛中存在两个长度都为706bp的非等位α珠蛋白基因,即α_1珠蛋白基因、α_2珠蛋白基因。它们在染色体上紧密排列,间距为2409bp。其中α_1珠蛋白基因排列在前,α_2珠蛋白基因在后。利用黄牛的β珠蛋白基因序列分别设计3对和1对引物来扩增牦牛的β珠蛋白基……   
[关键词]:牦牛;α珠蛋白基因;β珠蛋白基因;微卫星多态性;同源模建
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2005年