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水稻条纹病毒(RSV)免疫检测试剂盒研制与应用

刘海建

  水稻条纹叶枯病是近几年来在江苏省暴发流行的重大病害,该病害是由灰飞虱经卵持久性传播水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus,RSV)引起的。灰飞虱的带毒率高低是病害流行预测的重要因子,目前带毒率的检测方法主要有生物学方法、免疫学方法、分子生物学方法等,其中免疫检测比其他方法具有快速、便捷、灵敏、准确、廉价等优点。本文在已制备RSV单克隆抗体的基础上,首次研制了基于间接ELISA原理的灰飞虱和植物寄主带毒(RSV)测定的两种免疫检测试剂盒,该试剂盒可应用于RSV与灰飞虱互作关系的科学研究,并直接推广到基层植保部门,辅助病害流行预测预报。本文在实验室条件下从样品稀释度、抗体孵育时间、抗体工作浓度等几个方面对斑点免疫方法(DIBA)进行实验条件优化。确定37℃条件下,灰飞虱样品稀释100~200倍、病叶稀释200~400倍,单抗工作浓度1:20000~40000倍、孵育1h~1.5h,二抗使用1:2000~2500倍、孵育1.5h~2h为最佳实验条件。将单抗和二抗在不同温度条件下进行孵育时间比较试验,确定25℃条件(非实验室条件)下,样品在单抗与二抗中均孵育3h(其他条件同37℃)为最佳实验条件。通过以上实验,组装了一套RSV免疫检测试剂盒,建立了实验室(37℃)条件下和非实验室(25℃)条件下的使用方法,确定了4℃条件下有效期为6个月,如超过6个月,增加二抗使用浓度至1000~1500倍仍可有效使用。通过单雌产卵的方法,利用试剂盒检测灰飞虱亲本及其后代的带毒情况,对江苏13个县(市)田间灰飞虱进行亲和性群体筛选试验,除灌云、高邮、建湖、武进外,其他地区均筛选到高带毒亲和性群体,其中洪泽和盐都等地占有比例较高,分别为占自然种群的15.29%、17.39%,占当地带毒群体的52%和50%。该亲和性群体在带毒群体和自然种群中占有一定比例,是病害流行不可缺少的因素。利用试剂盒对不同地区、不同发病田块、不同世代、不同龄次、不同家系灰飞虱的卵传带毒情况进行比较分析,结果表明:不同地区灰飞虱带毒率差异显著,轻病区带毒率明显偏低:采样田块水稻发病率与灰飞虱带毒率高低不成比例,带毒率的高低可能与原始侵入灰飞虱种群带毒情况有关。越冬代、第一代和第二代灰飞虱带毒率呈“V”字型结构,暗示田间条件下灰飞虱带毒状况存在自然衰减和……