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特异性二价核酶基因构建与抗PLRV转基因马铃薯的研究

张剑峰

  根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的二价核酶序列。将该核酶基因克隆到pGEM-4Z中,构建成体外转录载体pGEM-4ZDR;同时将包含核酶切割识别位点的PLRV-Ch复制酶基因cDNA近5’端的874bp片段反向插入到pGEM-4Z中,构建了体外转录载体pGEM-4ZR5。以线性化的重组质粒pGEM-4ZDR和pGEM-4ZR5为模板,在T7 RNA聚合酶的作用下,分别转录获得核酶RNA和PLRV-Ch复制酶基因5’端负链RNA底物片段。将以上两种RNA转录物混合并经37℃保溫后,检测结果表明所得核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA在体外具有较强地特异切割活性。为了进一步培育抗卷叶病毒的转基因马铃薯,将所克隆的核酶基因导入双元质粒pROKⅡ中,获得植物表达载体pROKⅡ/DR,经三亲融合转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404),用于介导叶盘法转化马铃薯外植体。经PCR和Southern-blot检测,证明目的基因被成功地导入所得马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RNA dot-blot和RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。蚜虫传毒接种PLRV后的抗病性鉴定结果表明,所得到的转基因马铃薯株系分别表现出不同程度的抗病性。其中,经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在续发感染中仍表现出较高的抗病性,产量损失与感病受体品种对照相比明显降低。在防虫、无病小区中进行的产量鉴定试验表明,转核酶基因马铃薯株系间的产量变异幅度较大。其中对PLRV表现高抗的转基因株系L5和J-1产量与未转基因受体品种差异不大,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系奠定了基础。……   
[关键词]:二价核酶;马铃薯卷叶病毒;复制酶基因;体外切割;转基因马铃薯;抗病性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2005年