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利用不同策略获得抗SCMV转基因玉米的研究

白云凤

  玉米矮花叶病(MDM)是世界性病害,在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)的MDB株系(SCMV-MDB)引起。我们通过采用不同的策略,获得了高抗SCMV转基因玉米。先构建了无标记基因的SCMV-MDB复制酶基因NIb的反向重复序列(SCMVirNIb)表达载体pSCMVirNIb。通过冻融法将pSCMVirNIb载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农秆菌LBA4404,然后共转化玉米幼胚。通过除草剂梯度筛选,获得了Z3自交系再生苗,其中14株的标记基因和目的基因PCR扩增均呈阳性,目的基因DNA点杂交亦呈阳性。这14株的自交种子在冬季于温室种T_1代株行,人工接种SCMV,抗病株率高于60%的有11个株行。PCR检测抗病株,有一个植株只含有目的基因而无标记基因,即通过有性繁殖过程中的基因分离与重组,在T_1代得到了无标记基因的抗病转基因植株。根据T_1代植株抗病性鉴定和PCR检测结果,在田间种植了68个T_2代株系。在人工接种SCMV条件下,有3个株系的抗病株率高于85%,其中的一个株系来自T_1代无标记基因的抗病转基因植株。PCR进一步检测该株系的8个抗病株,均呈标记基因阴性,目的基因阳性。ELISA检测结果,转基因抗病株的OD值与未接病的健康株基本持平。用转基因抗病株叶片汁液回接,回接植株未表现感病症状,而非转基因对照的回接植株均表现感病症状,表明转基因抗病株不含病毒或含毒量很低,抗病性达到高抗甚至免疫水平。构建了SCMV-MDB的外壳蛋白基因(cp)和改造过的Bt毒蛋白基因(crylacm)的双价表达载体pCr-Cp,农杆菌介导转化玉米自交系Z31,获得了再生苗。根据叶片涂抹除草剂抗性鉴定和cp基因及crylacm基因PCR检测结果,在冬季于温室种植7个T_1代株行。对T_1代人工接种SCMV,各株行均有抗、感株分离。T_2代共种12个株系,人工接病、接虫,鉴定双抗性。结果T_2代的12个株系均尚在分离,其中1个株系的双抗株率高于50%。其双抗株的cp基因和crylacm基因PCR检测均呈阳性,Bt毒蛋白试纸条检测,2株的检测线比较明显,表明Bt毒蛋白得到了表达。即获得了兼抗玉米螟的抗SCMV转基因玉米,构建了无标记基因的SCMV—MDB反义cp基因表达载体pACP,农秆菌共转化玉米自交系Z3的幼胚,得到了再生株。T_1代人工接种SCMV,有2个株行的抗病株率高于70%。PCR检测抗病株,其中1个株行有2株cp基因阳性而标记基因阴性,获得了无标记转反义cp基因抗病株。……   
[关键词]:玉米;转基因;SCMV;dsRNA;无标记;双抗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2005年