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人扭转蛋白A的基因克隆表达及蛋白质纯化

周雪莹

  原发性扭转痉挛是一组由于躯干、肢体、颈部或颜面肌肉协调功能失调而出现各种姿势的异常或肢体的扭转,已有14种类型的扭转痉挛被定位。常染色体显性早发性扭转痉挛定位于9q34,是一种最常见、最为严重的扭转痉挛,1989年Ozelius等将该基因命名为DYT1,1997年又克隆出该基因,它编码332个氨基酸组成的DYT1扭转蛋白A(Torsin A),该蛋白是腺苷三磷酸酶AAA家族的成员,一种ATP结合蛋白,它与许多细胞活动有关。DYT1基因突变可引起9q连锁的扭转痉挛。在实验中,我们从人扭转蛋白A的编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板,成功地扩增到编码DYT1蛋白的基因片段,该片段全长939bp。将所得片段与pMD18-T载体连接,转化到JM109大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂法提取质粒,通过PCR和酶切分析,成功地筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致。提取质粒,用BamH I和Xho I酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a(+)和pGEX-6P-1中,转化JM109受体菌,从JM109受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,成功地构建了人扭转蛋白A原核表达载体。将该工程菌接种于含有适当抗生素的LB培养基中,37℃振荡培养过夜,次日将此菌液按1:100的比例接种于250mL LB液体培养基中,37℃振荡培养,当细菌长至适当的密度时,加入IPTG(终浓度为1mM)诱导,继续培养约5h,离心收集菌体,进行SDS-PAGE,结果在两种载体中均得到了高效表达。在pET28a(+)中表达的DYTI蛋白为包含体(IBS),经过IBS制备、蛋白质复性、金属鳌合层析纯化、superdex75凝胶过滤纯化,得到了纯的DYTI蛋白;在pGEX一6P一1中表达的DYTI蛋白与GST的融合蛋白也为IBS,但此融合蛋白复性不好,只得到极少量的融合蛋白。关键词:人;OYTI基因;扭转蛋白A;cDNA;克隆;原核表达;蛋白质纯化……   
[关键词]:;DYT1基因;扭转蛋白A;cDNA;克隆;原核表达;蛋白质纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2005年
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