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梨火疫病菌的分子检测技术研究

卢玲

  本论文主要进行了梨火疫病菌检测技术研究。选用梨火疫病菌的0056菌株,由戊二醛固定全菌体抗原,制备的抗血清效价和专化性都较高,可以用于ELISA实验。利用免疫吸附技术,研制了免疫吸附-PCR技术,使其检测纯菌的灵敏度比标准PCR技术提高10倍;检测样品中的梨火疫病菌灵敏度提高了1000倍;从相关混合菌液中能够更加灵敏和准确地检测出梨火疫病菌。该方法简单易行,准确灵敏,具有广阔的应用前景,也是直接利用PCR反应管吸附病原细菌提高PCR反应灵敏度的首次报道。利用本实验室自行设计的梨火疫病菌特异性引物REA-FEA,再次验证了免疫吸附-PCR技术的灵敏性和专化性,得到了同样的结果。选用16S-23S rDNA间的ITS(Intergenic Transcribed Spacer Region)序列的通用引物L1(5’—AGTCGTAACAAGGTAGCCGT—3’)和L2(5’—GTGCCAAGGCATCCACC—3’)对梨火疫病菌共10个菌种进行了ITS扩增,所有菌株均得到了一条分子量约为600bp的扩增产物。对参试的10个梨火疫病菌的扩增片段进行片段回收、克隆和测序,将这些序列与数据库中已经报道的其它ITS序列进行同源性比较,在此基础上设计并合成梨火疫病菌特异性引物REA-FEA。并用这对特异性引物分别对25个参试菌株进行PCR扩增。证明这对特异性引物具有很高的专化性。本研究还建立了在一个试管中一次完成的检测梨火疫病菌的单管Nested-PCR技术,利用细菌基因组16SrDNA通用引物和ITS通用引物对梨火疫病菌及其近缘种菌株的16SrDNA区域和ITS区域扩增,得出序列,设计并合成了两对引物。一对外部引物Eaf-Ear和一对内部引物FEA-REA。这两对引物有截然不同的退火温度,整个程序包括两个连续的PCR程序。把两对引物同时加入PCR体系,第一轮PCR程序在较高的退火温度下进行,因此只有外部引物起作用。用外部引物第一轮扩增后,紧接着再用内部引物进行第二轮扩增,扩增结果显示,灵敏度比标准PCR技术至少提高100倍,扩增灵敏度达到5×10~0cfu/ml的菌悬液。这种Nested-PCR检测技术只能从梨火疫病菌中扩增出约270bp的特异性条带,而不能从其它细菌菌株中扩增出这条片段。……   
[关键词]:梨火疫病菌;检测;内源转录间隔区域;免疫吸附-PCR;单管巢式PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2004年