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Chi和Glu的克隆与维管束特异启动子驱动的表达载体构建及其对甜瓜的遗传转化

刘玲玲

  甜瓜(Cucumis melo L.)是世界上广泛种植的水果之一,因其香甜可口、营养丰富,加之经济价值高,应用广泛而深受消费者青睐。但目前生产上使用的大多品种为抗性单一或抗病性差的品种,往往给生产造成严重的损失,故加强抗病性甜瓜品种尤其是广谱抗性品种的选育是提高甜瓜品质和产量的关键。通过常规育种方法将多抗基因集中到同一个品种的研究,不但耗时耗力,而且难度极大;加之甜瓜自身抗性基因资源缺乏,往往导致育种周期长而效率不高的问题。相比之下,植物基因工程技术是培育多抗性品种的一条十分便捷的途径,它可以打破物种间的界限,可以从微生物及其近缘植物中分离出抗病基因,然后通过遗传转化一次性将抗病基因导入受体植物品种以提高其抗病能力,具有目标明确,育种周期短和效率高的突出优点,现已成为抗病育种的尖端技术。本研究从美洲黑杨叶片中提取基因组DNA,克隆到维管束特异性表达蛋白(BSP)基因启动子功能区段,分子大小为860bp,其中富含A/T的区域和富含A/T的重复序列。通过序列对比分析与已报道的碱基序列有98.2%的同源性。以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报道基因,通过基因枪法转化烟草叶片,通过转化烟草维管组织的瞬时表达结果表明,该启动子具有维管组织特异性表达活性。设计特异扩增引物,采用PCR扩增技术从质粒pART27Tch中克隆到木霉几丁质酶(Chi)基因,该片段分子大小为1275bp,通过序列分析与文献报道的碱基序列有99.45%的同源性。同时设计特异扩增引物,从质粒pBLGC中克隆到烟草β-1,3-葡聚糖酶(Glu)基因,该片段分子大小为1088bp,通过序列分析与文献报道的碱基序列有99.81%的同源性。将Chi和Glu基因分别插入到微生物表达载体pET28a(+)的T7启动子和终止子之间,构建成N-端携带6×His标签子的原核表达载体,通过IPTG诱导表达,提取表达产物,进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,分别得到分子量约49.5kDa和42.5kDa的特异蛋白条带,证明Chi和Glu基因的表达产物的分子量与理论推算的相符。将表达产物进行抑菌实验,结果表明:几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶都对真菌有很强的抑制作用。构建了具有BSP-Chi-终止子和具有BSP-Glu-终止子的表达载体pBIC和pBIG,然后切下载体pBIG上的具有BSP-Glu-终止子的片段,插入到载体pBIC,构建了双价植物表达载体pBIBCG:采用直接导入法已将双价表达载体质粒导入农杆菌LBA4404得到了工程菌。采用农杆菌介导法,对甜瓜叶片和茎段进行了遗传转化,从不同受体材料的转化效果来看,试管苗叶片是遗传转化的较好材料,具有愈伤诱导率高,分化再生能力强,取材方便的突出优点。对2号和5号甜瓜品种进行了转化研究,结果显示农杆菌对甜瓜基因型存在依赖性,目前得到了2号品种的转化苗,正在进行继代繁殖,以便进行阳性植株检测。……   
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