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Bt基因重组工程菌毒蛋白的表达及其对昆虫的毒性研究

张红

  近年来,有关Bt毒蛋白基因遗传学和分子生物学的研究已取得显著进展,特别是用该基因构建工程菌成为研究的热点。本文分三个部分对Bt毒蛋白基因重组工程菌作了相关研究。第一部分研究了7个Bt毒蛋白基因在大肠杆菌中的表达情况。工程菌用LB培养基,在37℃下150~200rpm摇动培养24h。收集菌体,经反复冻融、超声波破碎、离心,最后进行SDS-PAEG电泳。结果表明,编号为ECE52、ECE128和ECE125的三个工程菌表达量较高,其中工程菌ECE52表达毒蛋白的量最高。对工程菌ECE52进行试管培养、摇瓶培养和发酵罐发酵的比较研究,发现工程菌ECE52在37℃下培养或发酵8~12h较为合适。毒蛋白的提纯经Sephacryl S-200凝胶过滤、pH9.5的Na_2CO_3/NaHCO_3缓冲液洗脱,紫外280nm下收集洗脱峰,SDS-PAGE电泳检测得单一蛋白染色条带,分子量约为133KDa。提纯后的毒蛋白饲喂4龄家蚕幼虫,24小时内死亡率为100%。第二部分对工程菌ECE52表达蛋白的杀虫活性进行了研究。工程菌ECE52和对照菌的发酵液处理桑叶后饲喂4龄家蚕幼虫,发现工程菌ECE52的表达蛋白有毒杀活性。一次性饲喂时当浓度分别为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml时,家蚕幼虫在72h、48h、24h内全部死亡。饲喂后24h、48h、72h的LC_(50)值分别为0.101mg/ml、0.045mg/ml、0.028mg/ml,LC_(95)值分别为0.325mg/ml、0.173mg/ml、0.070mg/ml。方差分析发现,表达蛋白的浓度和取食时间对家蚕幼虫的死亡率有极显著影响,而两者的交互作用对死亡率也有极显著影响。连续饲喂时,即使是低浓度经过长时间的饲喂也可引起较高的死亡率。没有死亡的幼虫,其体重大大减轻,不能正常化蛹。由此可以得出,工程菌ECE52中crylAa基因表达蛋白对4龄家蚕幼虫有很强的毒性,死亡率取决于表达蛋白浓度和取食时间,而且低浓度的表达蛋白对家蚕的生长发育有抑制作用。四川大学硕士毕业论文 第三部分研究了几个理化因素—几丁质酶、化学添加剂、超声波以及紫外线照射对工程菌ECE52表达蛋白毒性的影响。结果显示添加几丁质酶、ZnSO4、EDTA、甲酸均可提高工程菌ECE52表达蛋白对3龄家蚕幼虫的毒效,且随着添加物浓度(或活力)的升高,增效作用就越显著。单独用添加物处理过的桑叶饲喂家蚕幼虫发现添加物本身对家蚕幼虫几乎无毒性,高浓度的ZnSO4、EDTA对家蚕幼虫的致死率都为O,高浓度的几丁质酶、甲酸对家蚕幼虫的致死率只有3.3%。方差分析发现添加物的浓度和取食时间对死亡率有极显著的影响,而且添加物浓度和时间的交互作用对死亡率也有显著影响。运用统计学方法比较三种添加剂对工程菌表达蛋白毒力的增效性,结果发现三种添加剂中EDTA的增效作用最明显,它们的增效性强弱为:EDTA>甲酸>ZnSO;。浓度为o.25m留ml的毒蛋白溶液经超声波破碎10min后比没有破碎的对家蚕幼虫的毒性至少提高一倍;紫外线照射会降低毒蛋白的杀虫活性,照射30min会使工程菌ECE52表达蛋白对家蚕幼虫的毒性至少降低一倍,照射6Omin会使毒蛋白完全丧失杀虫活性。因此,添加几丁质酶、化学添加剂,超声波破碎,抵抗紫外线照射均可有效提高工程菌ECE52表达蛋白对家蚕幼虫的毒效。关键词:队毒蛋白:工程菌:表达蛋白;毒性;家蚕幼虫;增效性……   
[关键词]:Bt毒蛋白;工程菌;表达蛋白;毒性;家蚕幼虫;增效性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2004年