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鹦鹉幼雏病病毒全序列分析及VP1基因克隆与表达

寇铮

  鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar Fledgling Disease Virus BFDV)是引起鹦鹉发生高死亡率的急性病毒性传染病的病原。鹦鹉幼雏病(Budgerigar Fledgling Disease BFD)二十世纪八十年代初首先在美国和加拿大报道,研究证明此病是由病毒引起,命名为鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar Fledgling Disease Virus BFDV)。随后,此病迅速蔓延到日本、意大利、匈牙利、德国和澳大利亚等地。我国首次于1994年至1995年相继在湖北云梦县和青岛某集约化鹦鹉养殖基地暴发鹦鹉幼雏病流行,给我国养鸟业带来重大损失,至今鹦鹉幼雏病仍在我国某些地区散发流行,目前对于本病的防治尚无较好的控制手段。本研究针对湖北分离株BFDV-HBYM02毒株,采用分子生物学方法,进行全基因组序列测定与分析,以及相关重要功能基因的研究,为BFD的有效防治和检测手段的研究打下基础。本文主要完成了以下研究工作:(1)完成了BFDV-HBYM02毒株全序列测定:a.通过BLAST分析同源性,HBYM02株与GENBANK中仅有的6株BFDV全序列同源性为98%-99%,表明HBYM02株与这六株BFDV毒株为同一个基因型。分析不同基因组区域内碱基的变异,可知T抗原变异率最高,有18个碱基位点发生改变,未知蛋白没有碱基的改变,最为保守,推测T抗原高突变可能与BFDV广泛宿主范围有关,以适应其在不同鸟类中传播,未知蛋白高度保守对于BFDV晚期蛋白的表达调控起重要作用。b.采用Phylip3.5软件作出进化树,结果表明,来源于不同宿主的BFDV具有单独的进化规律,与宿主关系紧密,但是与地理分布没有明显的相关性。(2)HBYM02-VP1基因克隆:VP1基因是BFDV主要结构蛋白。根据HBYM02株全基因组序列设计VP1基因引物,通过PCR扩增VP1片段,采用pMD18T载体系统,构建HBYM02-VP1质粒。经BLAST分析,HBYM02-VP1与GENBANK内BFDV的VP1基因同源性为96%-99%,显示VP1是一个相对保守的基因片段。(3)HBYM02-VP1基因的表达:利用大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白分子量58KD,融合蛋白占菌体总蛋白的24%;经可溶性分析,确认表达产物主要以包涵体形式存在;重组蛋白经亲和柱层析纯化后纯度为90%。利用杆状病毒表达系统初步完成VP1基因的真核表达,重组蛋白分子量为42KD。经Western-blotting证明两个系统表达的VP1蛋白都具有免疫学活性。综上述,本文针对HBYM02株进行全基因组序列测定与分析,探讨其与已知BFDV分离株的同源性与进化关系,表明目前世界范围内的IBDV仅一种基因型,为BFDV的分子流行病学研究提供了分子基础,为各类有效控制BFD的各类疫苗的研制打下了基础。针对BFDV主要结构蛋白VPI具有很强的免疫原性,对HBYM02主要结构蛋白VPI基因进行克隆、原核表达和真核表达,HBYM02一VPI的表达为建立快速、灵敏的鹦鹉幼雏病血清学检测方法及疫苗的研制提供了科学依据。……   
[关键词]:鹦鹉幼雏病病毒HBYM02株;基因组序列;VP1基因;克隆与表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2004年