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猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究

李自力

  乙型脑炎病毒和伪狂犬病病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一,给养猪业造成了巨大的经济损失,同时乙型脑炎是一种人畜共患病,猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主,因此控制猪的乙型脑炎具有十分重要的意义。而预防和控制这两种传染病最有效的措施就是免疫接种。目前尚无商品化的猪用乙型脑炎疫苗,主要采用人用的两种乙型脑炎疫苗,而这些常规疫苗都存在一定的缺点。鉴于此,本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因PrM、PrM-E和NS1,构建了三株表达猪乙型脑炎病毒主要免疫原性基因的重组伪狂犬病病毒,即TK~-/gG~-/PrM~+、TK~-/gG~-/PrM-E~+和TK~-/gG~-/PrM-E-NS1~+,在此基础上研制了猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗,并进行了动物试验。主要研究工作和结果如下:1.乙型脑炎病毒PrM-E基因的克隆、测序与序列分析根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列,设计了一对引物,以RT-PCR方法扩增了其主要免疫原性基因PrM-E,并克隆至pMD18-T载体中,命名为pTPrM-E,序列测定结果表明,与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较,PrM的同源性均为100%,与SA14-14-2疫苗株比较,E基因发生了4个核苷酸的改变,即2181a-g,2317a-g,2441a-t,2443g-a,其中2317a-g为回复突变,共导致了3个氨基酸的改变,即E402 T-A,E447 D-G(为回复突变)和E489 G-D,而E488为无义突变,但未发生与毒力相关位点的突变。2.乙型脑炎病毒主要免疫原性基因重组伪狂犬病病毒的构建采用3对引物(各引入一个酶切位点)分别从pTPrM-E和pTNS1扩增PrM、PrM-E和NS1基因,双酶切后分别将PrM、PrM-E和PrM-E-NS1基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体PgG-uni中,分别得到三个重组转移载体,命名为PgG-PrM、PgG-PrM-E、PgG-PrM-E-NS1。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK~-/gG~-/LacZ~+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞,形成病变的转染物经空斑筛选纯化,PCR扩增和Southern印迹等鉴定,获得了三株纯化的重组病毒,分别命名为TK~-/gG~-/PrM~+、TK~-/gG~-/PrM-E~+和TK~-/gG~-/PrM-E-NS1~+。重组病毒在IBRS-2、PK-15和CEF细胞上增殖滴度依次降低,Western印迹表明JEV PrM、E和NS1基因在重组病毒中均获得了表达。表达的蛋白质大小分别为19KD、53KD和46KD。重组病毒与载体病毒在IBRS-2细胞上的增殖比较试验表明外源基因的插入不影响重组伪狂犬病病毒在细胞上的增殖滴度。3.三株重组伪狂犬病病毒的免疫原性研究利用已构建的三株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上培养增殖后制备成冻干的猪乙华中农业大学博十学位论文型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗。动物实验表明,其对小鼠和猪是安全的,而且免疫的Balb/c小鼠和断奶仔猪均产生了针对PRV和JEV的特异性免疫应答。重组病毒TK,/gG’用rM一E+和TK一G护rM一E一Nsl+产生的JEV抗体和特异性cTL活性基本一致,均略低于JEv弱毒疫苗株,而TK一/gG护rM+产生的特异性免疫应答稍差些。统计分析表明所有重组病毒产生的CTL活性与阴性对照相比,差异极显著(P< 0.01)。三株重组病毒和载体病毒免疫猪在首免后8周所产生的PRV抗体水平差异不显著印>0 .05)。结果表明重组病毒TK’/gG一用rM一E+和TK一/gG护rM一E一NSI+可以作为预防猪乙型脑炎和伪狂犬病的二价基因工程疫苗。关键词:乙型脑炎病毒:伪狂犬病病毒;基因克隆;重组病毒载体疫苗……   
[关键词]:乙型脑炎病毒;伪狂犬病病毒;基因克隆;重组病毒载体疫苗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2004年