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甘蓝型油菜耐盐基因克隆及表达研究

王劲

  利用基因工程技术培育作物新品种(抗逆和抗病等)是当前生物学研究的热点之一。拟南芥的Na+/H+逆向转运蛋白被证实具有将Na+从细胞质转运到液泡中储藏的能力,可用于基因工程育种以培育耐盐作物。为了探索不同植物Na+/H+逆向转运蛋白基因的耐盐性,我们选择十字花科植物中耐盐性较高的甘蓝型油菜沪油15(Brassica napus L.)为材料,利用RACE-PCR克隆技术,成功克隆了甘蓝型油菜的Na+/H+逆向转运蛋白基因BnNHX1(GenBank Acc. No. AY189676)。通过相关的生物信息学分析,发现该基因的核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列与十字花科拟南芥及其它植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因有一定的相似性,BnNHX1蛋白与拟南芥的AtNHX1相似性可达87%, 与Oryza sativa的 Na+/H+逆向转运蛋白相似性可达71% ;而与Homo sapiens NHE 相似性只有29%。用TMpred软件分析BnNHX1蛋白为一跨膜蛋白,有12个穿膜区域,跨膜区保守,属于Na+/H+逆向转运蛋白家族。 为了确认BnNHX1的功能,我们构建了植物双元表达载体pCAMBIA2300-BnNHX1,并通过冻融法将该重组质粒成功地导入根癌农杆菌菌株EHA105中,利用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草苗的PCR分析和Southern blot分析表明,外源基因BnNHX1已经整合到了烟草的基因组中,其拷贝数为1~10;Northern blot分析表明,外源基因BnNHX1已成功地在烟草苗转录;通过T1代遗传稳定性分析,转BnNHX1基因烟草分离比基本符合孟德尔(3:1)规律, T1代植株在200mMNaCl胁迫下可以正常开花结实。Na+/H+逆向转运蛋白基因是属于植物耐盐SOS基因家族中的SOS1基因,在植物耐盐的SOS途径中还有SOS2、SOS3基因,为了进一步阐明植物SOS途径的耐盐机理,我们以十字花科植物甘蓝型油菜沪油15(Brassica napus)为材料,利用RACE-PCR克隆技术,克隆了SOS2基因(Bnsos2, GenBank Acc. No.AY310413),该基因编码一丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,调节一些同K+和 Na+转运有关蛋白的表达和活性。通过相关的生物信息学分析,发现该基因的核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列与十字花科拟南芥的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因有一定的相似性。同时我们还作了在不同盐浓度下,该基因在植株中不同部位的表达分析。这些基因的克隆为利用遗传工程技术改良作物耐盐性打下了基础。……   
[关键词]:Na+/H+逆向转运蛋白基因;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因;基因克隆;耐盐;基因转化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:复旦大学2004年