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人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗—空间稳定脂质体研究

牛国琴

  鉴于人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗chTNT能特异性靶向肿瘤坏死区瘤细胞的核抗原—DNA-组蛋白复合物,作者希望尝试将chTNT作为靶向头基连接到空间稳定脂质体表面,制备成既具有较长血循环时间又能靶向肿瘤细胞核抗原的免疫脂质体,以期达到疗效不低于抗肿瘤细胞表面抗原抗体修饰的免疫脂质体,而又能靶向多种实体瘤细胞的目的。本文首先从普通和稳定性脂质体膜材料制备出发,制备了蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化卵磷脂(HEPC)、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺或氢化磷脂酰乙醇胺(MPEG-EPE或MPEG-HEPE)以及抗体与脂质体的桥连剂—吡啶二硫丙酰基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺或氢化磷脂酰乙醇胺(PDP-PEG-EPE或PDP-PEG-HEPE)及其中间体单氨基聚乙二醇(PEG-NH_2)。TLC、IR、HNMR证实所制备的膜材料均符合实验要求。空间稳定免疫脂质体(chTNT-SLs或IgG-SLs)的制备是采用高压乳匀法先制备出含PDP-PEG-EPE的空间稳定脂质体(PDP-SLs),再通过二硫苏糖醇(DTT)将其还原为表面带巯基的SLs(HS-SLs),最后与衍生化后的抗体连接即得,其粒径分布均匀,平均粒径约为140nm,稍大于修饰前粒径。包载阿霉素(DOX)则在制得PDP-SLs后进行,继后再连接抗体。采用硫酸胺梯度法包载DOX时,膜组成为EPC/Chol/MPEG-EPE或再加PDP-PEG-EPE的脂质体,包载条件以50℃、30min为优;膜组成为HEPC/Chol/MPEG-HEPE或再加PDP-PEG-HEPE的脂质体,包载条件65℃、30min为优,且药脂比为1:5时,包封率可达95%以上。空间稳定免疫脂质体的免疫活性是决定其能否主动靶向的关键。~(125)I标记法的检测结果表明:抗体连接效率为53.72%,脂质体表面抗体密度为75.23μgAb/μmol磷脂,处于较优的抗体密度范围内;chTNT和chTNT-SLs与Raji细胞的特异性结合率均约为5%,与其核抗原结合率约15%;chTNT、chTNT-SLs均能与~(125)I-chTNT竞争结合Raji细胞核抗原,提示二者均有相同的免疫结合位点。ELISA法测定结果表明:IgG-SLs免疫活性约为小鼠IgG的43.7%,chTNT-SLs的免疫活性约为chTNT的50%,提示采用硫醚键方式将抗体连接于脂质体表面PEG末端的方法能在一定程度上保留抗体的免疫活性;chTNT-SLs与Raji细胞、KB细胞核抗原均能特异性结合,提示其具有广谱抗肿瘤细胞核抗原的作用。空间稳定免疫脂质体的粒径及所包载DOX的膜泄漏稳定性决定着其在体内的生物学行为,在血循环中滞留时间长短是决定其能否靶向实体瘤组织的关键。放置过程中粒径变化结果提示,空间稳定免疫脂质体的稳定性介于普通脂质体和空间稳定脂质体之间;DOX-SL-IgG在37℃的PBS和1%人血浆中振荡放置10h药物泄漏或释放率分别为20.7%和9.5%,提示DOX空间稳定免疫脂质体膜阻止DOX泄漏性能较好;’“,I标记chTNT一CLS和chT’NT一SLS在大鼠体内药动学检测结果表明,后者在血液中清除慢,滞留时间比前者长。HPLC一荧光检测法测定Dox一sLS、Dox一sL一IgG和Dox在大鼠体内药动学的结果表明,药动学行为均符合两室模型,但DOX脂质体的tl几均比DOX长得多,提示DOX空间稳定免疫脂质体具有血液长循环特性。空间稳定免疫脂质体在实体瘤组织积聚程度是其能否发挥疗效的基础,影像学定位是了解其在靶位动态积聚程度和速度的一种较为直观的方法。将磁共振用顺磁性显像剂的主药成分札喷酸复合物(Gd一DTPA)包载于脂质体中,制备成Gd一SL一chTNT。通过对给药后不同时相点的荷SKOV3瘤裸鼠进行磁共振增强扫描,结果表明,Gd一SL一ch丁NT在瘤体部位强化特征不同于游离Gd一DTPA,表现为12h和24h的后续强化效应。提示:空间稳定免疫脂质体能在实体瘤积聚,且积聚是个渐进过程。DOX一SL一chTNT在荷SKOV3瘤裸鼠体内的初步抑瘤试验结果表明:DOX一SL一ch飞NT的瘤体相对体积和瘤重与空白对照组相比,均有显著性差异(P<0.ol和p<0.05);其体积和重量抑瘤率分别为41 .20%和42.34%,与接有非特异性小鼠杭体IgG的DOX一SL一IgG相比有统计学差异(P<0 .1);与Dox给药后对体重影响相比,DOx一SL一chTNT和Dox一sL一IgG组体重均稳中有升。提示:在相同药物剂量条件下,杭肿瘤细胞核单抗修饰的空间稳定免疫脂质体的杭肿瘤效果明显好于普通非特异性抗体修饰的空间稳定免疫脂质体,但两者均能明显降低DOX引起的毒副作用。……   
[关键词]:空间稳定免疫脂质体;抗肿瘤细胞核单抗chTNT;阿霉素;膜材料;稳定性;药动学;药效学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:复旦大学2004年