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AT细胞辐射敏感性的研究

王明明

  生物有机体的辐射敏感性是影响电离辐射生物效应的一个重要因素。不同种系、不同个体、不同组织和细胞、甚至不同生物大分子,对电离辐射的敏感性差异很大,即同一剂量的同种射线在相同条件下照射不同机体、组织、细胞或生物大分子时,产生的辐射损伤效应或者刺激效应可能截然不同。研究表明,细胞辐射敏感性主要与该细胞的DNA含量、细胞种类及其生化结构、细胞所处的细胞周期时相、细胞所处内外环境、细胞增殖速率、细胞对辐射损伤的修复能力和细胞清除自由基的能力等因素有关。最近二十年,随着临床肿瘤放疗和辐射防护学科的发展,细胞辐射敏感性研究逐渐成为放射生物学领域的热点。毛细血管扩张-运动共济失调症(ataxiaTelangiectasia,AT)是一种常染色体隐性遗传病,该病患者具有进行性小脑退化、早熟和肿瘤高发病率等多种特殊的临床表现及与临床表现相一致的高辐射敏感性、免疫缺陷、基因组不稳定性等特点。培养的AT细胞缺少正常的辐射诱发的细胞周期关卡,并出现与临床表现相一致的特征性表型。AT的缺陷性表型与AT细胞染色体11q 22-23的ATM基因功能失活有关。ATM是介导细胞对某种DNA损伤反应的信号传导系统中的关键蛋白。蛋白序列分析显示,ATM属于大真核蛋白家族,它调控细胞对DNA损伤的反应,包括DNA损伤的修复、基因重AT细胞辐射敏感性的研究中文摘要组、细胞凋亡和细胞周期关卡等。目的:本课题通过测定AT细胞染色体畸变率、细胞周期各时相细胞的份额、细胞凋亡率、DNA双链断裂及其修复程度、细胞培养介质中超氧阴离子自由基浓度、细胞3H一TdR掺入率,与正常成纤维细胞GM作比较来研究电离辐射对AT细胞增殖、细胞周期分布、细胞凋亡、染色体畸变、细胞释放超氧阴离子自由基及细胞DNA双链断裂及其修复的影响,对 AT细胞辐射敏感性的机理进行初步探讨,进而为AT病研究提供生物学依据。方法:(1)细胞培养:将AT和GM两种成纤维细胞接种于含15%小牛血清的DMEM或RPMI 1640培养基,37℃、5%COZ条件下传代培养。(2)细胞照射:应用60CoY源对细胞进行不同剂量照射,剂量率为IGy/min;(3)染色体畸变分析:常规染色体制片,对O,1,2,3,4Gy剂量组分别观察400一1200个中期分裂相,计数其中出现的双着丝粒和着丝粒环;(4)细胞周期:根据细胞中DNA含量,应用流式细胞仪分析G。/GI、S和G:/M细胞所占的份额;(5)细胞凋亡检测:用酚、氯仿及异戊醇法抽提DNA,琼脂糖电泳分离DNA片断,观察细胞凋亡过程中产生的DNA断片;根据细胞膜受照后磷脂酞丝氨酸外翻的特点,以AnnexinV一FITC ApoptosiS DetectionKit工处理细胞,FACS法测定细胞调亡率。(6)DNA双链断裂与修复:胰蛋白酶消化照后培养不同时间的细胞,离心清洗后与低熔点琼脂糖混合、冷却成块,置于点样户a,细胞辐射敏感性的研究中文摘要孔中,CHEF MAPPERT,型脉冲电场凝胶电泳仪进行电泳,观察DNA断裂与修复情况。(7) 3H一TdR掺入:培养开始时加入lml浓度为3.5 x 105/ml的细胞悬液2.smlRPMll64O培养液和浓度为2.22 x IOSBq/ml的3H一TdRZO pl,培养24h或48h后,以0.25%胰蛋白酶消化细胞,滤膜法制样,液体闪烁法测定各样品的cpm值(每分钟脉冲计数)(8)超氧阴离子自由基含量测定:细胞培养条件、细胞密度及培养时间同3H一TdR掺入实验,培养终止前sh,换用无色RPMll64O培养基培养细胞,同时加入浓度为160 pM的氧化型细胞色素C 60pl,细胞色素C还原法测定培养上清液光密度(OD值),根据克分子消光系数换算成。2一浓度(nmol/h/1护细胞);结果:(l)AT和GM细胞染色体畸变率随受照剂量增加而升高,并且相同剂量照射后,AT细胞畸变率·明显高于GM细胞。(2)GM细胞随着照后时间的延长和照射剂量的增大,GZ/M期细胞比例逐步增大,发生GZ期阻滞;而AT细胞随着照后时间的延长和照射剂量增大,GZ/M期细胞比例逐步减小,未发生GZ期阻滞。(3)AT和GM两种细胞的凋亡率均随剂量增大和照后时间延长而增大,且剂量相同或时间相同时,前者凋亡率均高于后者。(4)GM和AT两种细胞受到O一6Gy6OCoY射线照射后,其DNA双链断裂程度随剂量增大而加剧,且随照后培养时间延长,二者DNA双链断裂损伤均有不同程度恢复;同一剂量点或照后同一时刻,AT细胞的DNA断片数大于AT细胞辐射敏感性的研究中文摘要GM细胞。(5)AT和GM两种细胞的增殖程度与细胞产生O‘的量密切相关,AT和GM两种细胞向培养介质中释放仇一的量均随辐照剂量增大而减小,且相同照射剂量下,AT细胞释放仇一的量减少得比GM细胞快。与此相对应,两种细胞的存活率也均随剂量增大而减小,相同照射剂量下,AT细胞存活率下降得也比GM细胞快。表明细胞。2一释放能力的改变直接影响到该细胞的辐射敏感性。结论:1.AT细胞缺乏辐射诱发的细胞周期关卡及DNA双链断裂损伤修复机制存在缺陷是AT细胞高辐射敏感性的原因。2.AT细胞的增殖和存活均与其02一释放能力密切相关。AT细胞受照后02一释放能力的改变与其高辐射敏感性之间存在紧密联系。……   
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