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常见致病菌通用芯片检测方法的研究

郑桂丽

  目的:利用生物芯片进行细菌的高通量检测和鉴定已成为很多人的共识,但至今为之还未真正实现。为建立细菌性生物恐怖剂和重要医学细菌的筛查方法,本研究旨在建立一种基于16S rDNA寡核苷酸芯片的检测和鉴定常见致病菌的技术。方法:以16S rDNA为靶标,针对待检细菌设计合成一系列寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。由于16S rDNA的保守性,针对每个细菌的四个可变区设计出4条探针。以本室保存的包括近缘和远缘细菌在内的135种共计300多株细菌对探针进行了验证和筛选。根据一种含26条种特异性探针的试验芯片,对芯片的杂交和洗涤条件等进行了摸索,并确立了新的数据分析方法。以筛选得到的探针,重新制备新的寡核苷酸芯片。待检细菌DNA经通用引物扩增标记后,与芯片杂交,对杂交图谱分析归纳,得到一套种/属特异的检测模式。待检样本与芯片杂交后,结果与种/属特异的检测模式相比,根据相似性大小判断样本的种类。以本室保存的部分样品对其进行了特异性验证。最后进行了混合样品检测试验及灵敏度试验。结果:针对79种靶标细菌分别设计的4条探针,共316种,以本室保存的135种共计300多株细菌进行杂交验证,结果剔除了12个“交叉”反应严重的探针,60个始终没有信号的探针,以及63个最初设计时即相互重复的探针后,最终确定有效探针181个。以含有针对7种细菌的26条探针的芯片为模型,初步探讨了利用16S rDNA寡核苷酸芯片鉴定致病菌的可行性。在已有条件基础上,优化了杂交和洗涤条件,缩短了杂交时间。在此基础上,分析比较了几种常见的数据分析方法,确定了以相对信号强度为依据的信号阴阳性判断思路,以及以特异性寡核苷酸谱(杂交图谱)为基础的细菌检测方式。结果表明,利用寡核苷酸芯片实现致病菌高通量鉴定是完全可行的,提出的信号判断方法保证了鉴定结果的稳定性,使鉴定结果受样品浓度及杂交过程差异等的影响程度减小,使用实验室保存的部分菌株进行初步考核,证实其具有较强的特异性和重复性。此外,为给后续的实验选择合适的阳性和阴性等参照,在此芯片中引入四种参照探针进行试验,结果证实EUB338ACTCCTACGGGAGGCAGC基本可以胜任阳性参照的作用,来源于λ噬菌体的AGAATATGGCGGCGATGCT还和部分菌种有交叉现象,不能作为阴性参照,而poly(T)_49和50%DMSO位点的信号强度均很小,可以胜任阴性和空白参照的作用,以作为芯片杂交和洗涤质量控制的标准之一。以经过验证的EUB338 ACTCCTACGGGAGGCAGC以及在探针验证过程中证实交叉反应最严重的其中两个探针:Acl’netobacte:haem口如ticus(溶血不动杆菌)的3号探针TCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATC(ID%=100%)和4号探针AeAoAG以AoeTTG以AeTGATeT(xDo;o=1 000;0)为阳性参照,poly(T);9和50%DMso为阴性和空白参照,加上确定的181个有效探针,重新设计并制备新的检测芯片。利用通用引物sua和gO7b对涉及31个属126种细菌(包括可获得的靶标细菌,及其同属内的其他近缘细菌,和某些不作为靶标细菌,但可供分析的菌株数较多的细菌)进行扩增和标记后,与芯片杂交,对杂交图谱分析归纳,得到一套种(属)特异的检测模式,共计62种,分别针对不同的种、属,或为几个种或属的混合模式。确立检测模式后,从已提取的模板库中随机选取了包括远缘和近缘细菌在内的 228份样品(104种菌)进行特异性验证。结果表明,大部分样品可准确地鉴定到种或属的水平,没有对应模式存在者,则没有对应的可信结果,即最大的相似性指数一般都小于75%,鉴定准确率为93.42%(213株正确,巧株错误)。该芯片检测系统不能区分李斯特氏菌(属)和除炭疽芽抱杆菌外的大部分芽抱杆菌,这两类细菌对应的阳性信号都较少,在混合样品中也容易被其他细菌的阳性信号所掩盖,因此针对这两类细菌可能需要进一步改变杂交条件,或样品制备方法,以增加它们的阳性信号数量,从而增加相互之间的分辨能力,同时在混合样品中又不致被其他细菌的杂交信号所掩盖。个别菌种检测结果出现偏差,但由于没有对应模式存在,需要进一步验证,包括硝酸盐阴性不动杆菌、摩氏摩根氏菌、沃氏葡萄球菌和和泰拉维沙门氏菌等。以金黄色葡萄球菌、炭疽芽抱杆菌和鼠疫耶尔森氏菌三种比较典型的致病菌为例,研究了该芯片检测系统的灵敏度问题。炭疽芽抱杆菌和鼠疫耶尔森氏菌灵敏度较好,30因体系中最低可检测到的细菌数分别为5.2 X 103cfu和7.1 X 102cfu,金黄色葡萄球菌显然较差些,达7.4 xl护cfu时才被检测到,但此灵敏度较低并不意味者该芯片检测系统灵敏度就很差,因为其实际上取决于样品的提取和扩增效率。染色体稀释灵敏度试验证实了样品提取对芯片检测灵敏度的影响,三种菌(金黄色葡萄球菌、炭疽芽抱杆菌和鼠疫耶尔森氏菌)的最低检测浓度分别为4.sng/ml、12.45ng/ml和63lPg/ml,金黄色葡萄球菌灵敏度为中间水平。混合样品的盲测试验和不同浓度比例混合样品的检测结果说明,样品中存在多个菌种时也可检测出来,但一般只能检测出占主导地位的几种细菌,如所占比例大于10%的某些细菌(如乙酸钙不动杆菌),针对不同的细菌,该比例底限会有所变化,……   
[关键词]:16S rDNA;寡核苷酸芯片;通用检测系统;致病菌
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2004年