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山羊体细胞核移植的研究

刘凤军

  为了优化山羊体细胞核移植体系,本论文研究了体细胞核移植操作过程中的几个影响因素:(1)体外培养体系对山羊胚胎早期发育的影响;(2)胞质去除及CB处理对山羊孤雌胚和核移植胚早期发育的影响;(3)供体细胞类型、重组胚构建方法及细胞冷冻对山羊体细胞核移植胚早期发育的影响。1.在SOFaa、CR1aa、mCR1aa三种培养液中添加不同浓度的成年山羊血清(NGS),观察其对山羊孤雌胚胎进行体外培养的效果。结果表明,山羊孤雌胚胎在这三种培养液中,以添加10%的NGS对早期发育效果较好,囊胚率分别可达62.79%, 53.52%, 13.64%;mCR1aa组囊胚发育率和囊胚细胞数显著低于SOFaa组和CR1aa组,SOFaa组和CR1aa组间无显著差异,SOFaa组优于CR1aa组。2.将MII期的卵母细胞用CB处理(试验组I)或去除部分细胞质不去核(试验组II)或在CB处理后再去除部分胞质不去核(试验组III),以及不做任何处理(对照组),经孤雌激活和体外培养观察发育情况。结果:试验组I、II、III以及对照组均获得了较高的囊胚期发育率 (依次为55.50%、37.43%、39.78%、59.82%),及较高的卵裂率(分别为72.35%、71.55%、64.87%、86.15%),但试验组I、II的分裂球不均匀的卵裂率明显高于试验组III与对照组。3.以乳腺细胞、胎儿成纤维细胞和颗粒细胞作为供体进行核移植,对比了细胞冷冻及核移植的重建方法(胞质内注射、电融合)对重组胚早期发育的影响。结果:(1)乳腺细胞支持重组胚的发育能力(囊胚率,7.14%)显著低于成纤维细胞(16.19%)和颗粒细胞(19.01%)(P<0.05),卵裂率无显著差异(P>.05);(2)以上三种体细胞在冷冻-解冻后支持重组胚发育力方面无显著差异(P>0.05);(3)乳腺上皮细胞构建重组胚的效率电融合组(69.52%)极显著高于胞质注射组(59.20%)(P<0.01),囊胚发育率无显著差异(P>.05)。成纤维细胞的重组成功率、卵裂率和囊胚率在两组间均无显著差异(P>0.05)。颗粒细胞重组成功率胞质内注射组(82.17%)显著高于电融合组(50.99%)(P<0.05),囊胚发育率无显著差异(P>.05),胞质内注射组稍高于电融组。结论:(1)在本实验条件下,山羊孤雌胚胎的体外培养以SOFaa为培养液,在培养的第72h时加入10%的NGS的发育效果较好,囊胚率可达62.79%。(2)CB处理对孤雌胚发育无影响,胞质去控制在CB结合去除1/3以内对孤雌胚的发育影响不大,CB处理与胞质联合对山羊孤雌胚早期发育起协调作用,提高卵母细胞孤雌胚发育力,并降低卵裂异常现象。(3)在山羊体细胞核中,上述三种细胞支持重组胚的发育力以成纤维细胞和颗粒细胞较好;细胞冷冻对其无显著影响;在构建重组胚方法上,乳腺细胞以电融合法为宜,颗粒细胞是胞质内注射法优于电融合法,而成纤维细胞两种方法均可。……   
[关键词]:体外培养;核移植;体细胞;山羊;胞质内注射;电融合
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年