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马铃薯Y病毒N株系蚜传相关蛋白HC-pro基因的克隆及原核表达

杨旭光

  植物病毒是一种分子生物,他一般不能在细胞外独自存活,它们在自然界的传播是通过各种介体昆虫,线虫和真菌这些小型细胞生物完成的,病毒和这些不同的传播介体之间发展起多种高效专化性的传毒过程,使得病毒能够在自然界存活并传播扩展开来。马铃薯Y病毒是马铃薯Y病毒属的成员,能够被蚜虫非持久性传播,主要危害马铃薯和烟草,造成严重的经济损失。马铃薯Y病毒基因组编码的HC蛋白是和蚜虫传播相关的一个蛋白因子,并且和病毒自身的许多生命活动相关。本试验通过设计特异性引物,利用RT-PCR技术从陕西获得马铃薯Y病毒N株系分离物中克隆出了HC基因并进行原核表达研究,主要结果如下:1.分离田间采集的马铃薯Y病毒坏死株系,获得陕西地区马铃薯Y病毒的分离物;以其为材料,接种烟草后,提取病株RNA;优化扩增体系,RT-PCR反转录扩增获得大约1.4kb左右的PVY-N的HC-pro基因片断。2.将HC-pro基因克隆进克隆载体pBLueKS中,转入大肠杆菌DH5α菌株中大量繁殖。3.用pBV221、pET30a和pTrcHisA分别构建含HC-Pro的原核表达载体pBVHC、pETHC、pTrcHC。转化大肠杆菌BL21诱导表达后发现DBVHC的表达量最高。4.通过一系列的梯度试验发现,在不同的预培养时间下,原核表达载体pBVHC对HC-pro蛋白的表达丰度不同,其中,37℃预培养4小时,42℃热激培养6小时后获得的菌液目标蛋白的浓度最适合于纯化。5.利用电透析的方法纯化回收pBVHC表达的大量目标蛋白,免疫家兔后,采血获得HC-pro蛋白的抗血清。6.琼脂双扩散的方法检测抗血清,用Western blot对感染马铃薯Y病毒的烟草总蛋白进行免疫印迹试验,为进一步的试验做准备。马铃薯Y病毒HC蛋白在马铃薯Y病毒属内甚至于种内均存在着一定的差异性,本试验从陕西分离获得马铃薯Y病毒N株系的HC基区,原核表达的研究以及抗血清的制备后,为进一步的同源性分析和蚜传专化性位点的分析 以及分离提取蚜传受体蛋白,并通过基因工程和分子生物学技术为蚜虫受体蛋白的研究打下了坚实的基础。……   
[关键词]:马铃薯Y病毒;蚜传相关蛋白;HC-pro;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年