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苦皮藤内生真菌农用活性成分的研究

顾爱国

  本论文以一株编号为 2B 的苦皮藤内生真菌为出发菌株,应用形态学的方法鉴定了其种属地位;研究了其代谢产物的农用生物活性,并对目标活性物质进行分离和结构解析,采取诱变育种手段选育了高产菌株,并对高产菌株的发酵条件进行了优化。通过试验结果的分析和讨论,取得了以下结论:1 根据真菌的分类及鉴定方法,用光学显微镜观察 2B 菌株气生菌丝、大型分生孢子、小型分生孢子及菌落性状,对比相关分类系统,将 2B 菌株鉴定为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。2 在对 2B 菌株发酵产物生物活性研究中,发现 2B 菌株发酵产物甲醇提取物有明显的抑菌活性,在 1000 μg·mL-1浓度下对番茄早疫病菌(Alternaria solani)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)4 种供试菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率均大于 80%;在盆栽试验中,对黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)的治疗和保护作用均在 70%以上。3 采用常压柱层析、HPLC 制备等方法,在生物活性追踪指引下,从 2B 菌株发酵产物分离出 4 个化合物 2B-1,2B-2,2B-3,2B-4。经波谱技术( IR,1H NMR,13C NMR,COSY,MS),结合化学检验方法,并与相关文献对比,将分离得到的化合物分别鉴定为 enniatin B,enniatin B1,enniatinA1,ergosterin。化合物 2B-1,2B-2,2B-3 在 100μg·mL-1浓度下,对玉米大斑病原菌菌丝生长抑制率分别为 68.18%,87.49%,90.91%。4 建立了恩镰孢菌素(enniatins)的 HPLC 检测方法。检测条件为色谱柱 (C18 柱,0.9×30cm,10μm);流动相(V∶V)甲醇∶水(88∶12);流速 1 mL·min-1;检测波长UV229nm;室温下 5μL 进样,该方法相对标准偏差 RSD< 1%,平均回收率在 98%以上。5 采用紫外线(UV),甲基磺酸乙酯(EMS),超声波+UV + EMS 3 种诱变方式进行复合诱变,同时结合形态变异与产量之间的相关关系,挑选形态差异明显的单菌落,然后通过摇瓶发酵筛选 enniatins 高产菌株,通过 3 轮诱变筛选大幅度提高了菌种的生产能力,最后得到的突变株 UE152 代谢 enniatinns 总产量为 59.72 mg·100mL-1,是出发菌株摇瓶效价 2.9 倍,且该突变株的高产遗传特性稳定。6 通过单因子试验和多因子正交试验筛选获得 UE152 菌株最佳的摇瓶培养基配方和发酵条件为葡萄糖 2%、土豆 20%、蛋白胨 0.5%、NH4Cl 0.3%、MgS040.1%和 CaCO30.1%,培养温度 26℃,接种量 10 块菌饼(每 50 mL 发酵液),初始 pH 值为 6.0~7.0,装液量 50 mL(每 250 mL 三角瓶),转速 160rpm,发酵时间 120h。在上述实验条件下enniatinns 总产量可达 88.68 mg·100mL-1,从正交试验结果分析当中看出,如果适当增加通气量,产量可望更高。……   
[关键词]:内生真菌;活性成分;结构鉴定;菌株选育;发酵条件
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年