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原生质体融合构建增香型猕猴桃酒酵母的研究

王丽威

  我国是世界上猕猴桃生产大国,但鲜果加工业相对落后,造成农民卖果难。猕猴桃酒营养丰富,对人体具有多种保健作用。充分利用猕猴桃资源,发展猕猴桃酒,可以增加猕猴桃产业的附加值,推动猕猴桃产业健康发展。但由于缺乏猕猴桃酒发酵专用酵母菌种,导致生产的猕猴桃酒香气不足、果香不突出、典型性欠佳,严重影响了猕猴桃酒的质量。应用现代生物技术,构建增香型猕猴桃酒酵母将对改善猕猴桃酒质量起到关键作用。原生质体融合技术作为一种最为有效的工业微生物育种手段之一,能够实现基因的大量、高频、多位点的重组和整合,适合用于增香酵母的构建。本研究以一株发酵力强的酵母和一株产香性能好的酵母作为亲株,通过单亲灭活原生质体融合技术,构建出增香型猕猴桃干酒酵母,用以增强猕猴桃酒香气,较大程度改善猕猴桃酒品质。研究结果表明:1.通过对Y1、Y2、Y3、Y4等4株酵母的发酵力、发酵过程中糖度变化趋势、原酒主要理化指标和成品酒感官品评结果综合分析,选取Yl和Y3适合作为融合亲本。2.紫外线诱变方法制备Y1单倍体遗传标记,得到一株组氨酸缺陷型突变株。3.亲株原生质体制备的适宜条件①菌龄:斜面菌种转接于5ml YEPD液体培养基,振荡培养12h,按1%接种量转接于50ml YEPD液体培养基中,振荡培养5h,菌浓度达107个/m1。②预处理:菌体108。个,预处理液3mi,30℃恒温水浴,振荡处理15min。③酶解条件:菌体lO8个,蜗牛酶浓度20mg/ml,酶用量60mg,酶解温度37℃恒温水浴,间歇微振荡。Y1(hi s一)酶解45min,原生质体形成率98.2%,再生率20.3%;Y3酶解60min,原生质体形成率95.3%,再生率21.3%。4.Y3原生质体灭活条件:80 C恒温水浴处理30min,灭活率达100%。5.融合条件:两亲株原生质体各108个,1:1比例混合,30℃恒温水浴中预培养15min,促融剂2ml.,30℃融合30min,融合率达10-8。6.检出的69株融合子经初筛,得到10株发酵力强的融合子。进一步的猕猴桃酒发酵试验结果证明,与亲株相比,融合子F25和F41与Y1具有同样强的发酵力;发酵的猕猴桃酒理化指标和感官品评结果表明,融合子整合了亲株的优良性状。7.GC—MS香气成分分析结果表明,亲株和融合株发酵酒的香气成分在种类上和含量上均有差异。进一步的主成分分析结果表明,各菌株香气成分的差异主要在于2-丙酸丁酯、乙酸异戊酯、己酸、2.苯乙醇、琥珀酸单乙酯、4一羟基-苯乙醇、2-甲基琥珀酸二乙酯、3.羟基.4.甲氧基.苯甲酸、肉桂酸乙酯等10种成分的含量和配比。8.亲株和融合株发酵酒的香气成分聚类分析结果表明,各融合子在香气上与亲株:Y3相近,Y3真正起到了香气供体的作用。9.融合子鉴定结果表明,得到的10株融合子是真正的融合子,且具有遗传稳定性。……   
[关键词]:原生质体;融合;猕猴桃酒;增香;酵母;单亲灭活
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年