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三种中国地方畜禽成纤维细胞库构建及北京油鸡GPAT基因的克隆和序列分析

于太永

  本论文以北京油鸡、狼山鸡、小尾寒羊为研究对象,采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻技术构建成纤维细胞库,采用生长曲线、染色体分析、同工酶分析等方法对细胞生长动态、遗传稳定性、种间交叉污染等进行检测;采用基因克隆技术和相关分析软件对北京油鸡GPAT基因进行克隆和序列分析。旨在细胞水平上保存该三种畜禽品种遗传资源,为在基因水平上保存北京油鸡特异性状奠定基础,为其他畜禽品种资源保存提供借鉴。试验结果如下:1所培养细胞的形态为长梭形或不规则三角形,生长时呈火焰状或旋涡状走势。2北京油鸡、狼山鸡、小尾寒羊细胞冻存前活率分别为97.5%、96.0%和97.0%;复苏后的活率分别为95.0%、94.5%、94.7%。3该成纤维细胞生长曲线呈典型的“S”型,第2天起细胞倍增时间约为24h,第5天起细胞生长渐缓。4染色体分析结果表明,北京油鸡、狼山鸡、小尾寒羊成纤维细胞均以二倍体为主,二倍体染色体数目分别占所观察数目的87.1%、86.7%和93.4%;染色体结构变异率分别为1.5%、0.8%和1.4%;染色体形态与前人报道的其他品种相比略有不同。5LDH同工酶谱带分析表明,北京油鸡、狼山鸡成纤维细胞为两条谱带,小尾寒羊为5条谱带:MDH同工酶谱带分析三种品种均为两条谱带,但小尾寒羊的迁移率明显高于北京油鸡、狼山鸡。6微生物污染检测显示,所培养的三种畜禽品种的成纤维细胞均呈阴性。7脂质体介导质粒pEGFP-N_3分别转染三种品种的成纤维细胞,10h后均可获得较好的转染效果。8北京油鸡GPAT基因克隆和序列分析结果显示:该基因长度为953bp,其中含288A,177C,272T,216G,(A+T)%为58.76%,(G+C)%为41.24%;与已发表的鸡的GPAT相比其同源性为84.63%,碱基变异率为15.37%,在365 bp处的左翼有5个碱基插入,在423-429bp处有5个碱基缺失,在631处有1个碱基缺失;与人的该基因序列相比,其同源性为81.41%,北京油鸡该序列在243bp和326bp处各有3个和2个碱基缺失;与小鼠的该基因序列相比,其同源性为78.09%,北京油鸡该序列在145bp和556bp处各有1个碱基缺失;利用Oligo6软件分析,该序列含有5个HaeⅢ酶切位点,有2个Alw26 Ⅰ酶切位点3个Taq Ⅰ酶切位点。……   
[关键词]:地方畜禽品种;成纤维细胞;GPAT基因克隆;遗传资源保存
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年