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已烯雌酚免疫分析的研究

陈德坤

  己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)属于人工合成的雌激素,在人和动物体内会产生雌激素样效应。鉴于 DES 对人体的致癌和致畸作用,世界各国均规定食品动物养殖中不得以任何途径和方式使用 DES,养殖动物及动物性食品中不得检出 DES。DES 残留免疫分析是 DES 残留监控中的关键手段之一。项目对 DES衍生物制备、DES 人工抗原合成、DES 多抗制备及检测方法、DES 单克隆抗体研制等进行了研究。建立了己烯雌酚半琥珀酸(DES-HS)的制备方法。避光条件下,以己烯雌酚与一定量的丁二酸酐为原料在室温条件下于无水吡啶中搅拌 34h,酸性环境中静置过夜,有浅棕色油状物析出,过滤,将得到的浅棕色沉淀减压蒸干,得粗产品。将粗产品纯化后,经核磁共振、红外光谱、高分辨质谱鉴定。结果表明,该棕黄色物质分子量为 368,分子式为 C22H24O5,含有酚羟基、羧基等关键基团,为所要制备的 DES 衍生物己烯雌酚半琥珀酸(diethylstilbestrol hemisuccinate, DES-HS)。应用混合酸酐法将 DES-HS 与载体蛋白(BSA,OVA)偶联,得到 DES 人工抗原。 合成的人工抗原经紫外扫描、SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定证明 DES-HS 与载体蛋白偶联成功;并用 UVP Bioimaging system 中的 labworks 4.0 ImageAcquisition and Analysis software 分析估算 BSA 与 DES-HS 的偶联率为 1﹕30~32,OVA 与 DES-HS 的偶联率为 1:25~28。以合成的 DES-HS-BSA 免疫兔,经 6 次加强免疫后,用琼脂双扩散试验测定免疫血清中 DES 抗体特异性及效价;探讨了间接 ELISA 测定 DES 抗体的条件;在摸清免疫血清工作浓度的基础上,对免疫血清中 DES 抗体与游离 DES 的特异性结合反应进行测定。结果显示,免疫血清在琼脂双扩散试验中能够和 DES-HS-OVA、DES-HS-BSA 形成清晰的沉淀线,并且与 DES-HS-BSA 形成的沉淀线较粗,与DES-HS-OVA 形成的沉淀线较细,琼脂双扩散试验测定出 DES 的抗体效价为 22.5~22.6;找出了间接 ELISA 测定 DES 抗体的最佳条件,即用 4μg/mL 的 0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液包被酶标板过夜,1%的 OVA PBST 在 37℃封闭 1h,一抗、酶标二抗的作用时间均为 45min,TMB 底物作用时间为 15min,终止液 H2SO4的浓度为 1M,建立了间接 ELISA 测定 DES 抗体的方法;间接 ELISA 测定结果表明两组兔免疫血清与 DES-HS-OVA 反应的 OD490nm值分别为 3.459±0.045、3.738±0.136,与 OVA反应的 OD490nm值分别为 0.235±0.080、0.131±0.007;间接 ELISA 测定两组兔免疫血清的 DES 抗体效价均达到 1:6000;在确定了免疫血清适宜稀释浓度为1:100 的基础上,间接阻断 ELISA 试验表明游离 DES 可以和免疫血清发生特异性结合反应,并且随着游离 DES 加入量的增加,免疫血清中能够与 DES-HS-OVA 反应的抗体量不断减少。上述结果证明用 DES-HS-BSA 免疫兔后,能够刺激兔免疫系统产生抗 DES 决定簇的抗体,该抗体不仅能够特异性识别人工抗原DES-HS-BSA、DES-HS-OVA 上的 DES 决定簇,还能够识别游离 DES 并与其发生特异性结合反应。用 DES-HS-BSA 免疫 Balb/c 小鼠 4 次后,间接 ELISA 测定免疫小鼠体内的DES 抗体效价,13 只小鼠的抗体效价均在 1:8×103以上。取 2 只免疫效果最佳小鼠的脾细胞,在 PEG 作用下与 SP2/0 细胞融合。经过筛选,3 次克隆化后,得到 2 株生长稳定、DES 单抗分泌量较高的杂交瘤,分别命名为 3A8、4E6;分别对两株单抗的细胞培养上清、腹水中 DES 抗体效价进行了测定,4E6 株细胞培养上清、腹水中 DES 抗体效价分别为 1:6×104、1:1×107;3A8 株细胞培养上清、腹水中 DES 抗体效价分别为 1:4×104、1: 1×107;用间接 ELISA 分别对 3A8、4E6株培养上清中 DES 单抗的特异性进行了分析,两株杂交瘤分泌的单抗只与 DES决定簇发生特异性结合反应。本研究通过将 DES 转化为人工抗原,免疫兔、小鼠,成功地制备出了 DES 抗血清和单克隆抗体,为研制拥有我国自主知识产权的 DES 残留免疫检测试剂盒提供了一个良好的技术平台。……   
[关键词]:己烯雌酚;人工抗原;单克隆抗体;免疫分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年