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卡介菌基因组DNA的制备及其对支气管哮喘和肺纤维化防治作用的研究

王静

  目的:TH细胞按其功能和分泌的细胞因子的不同可分为两群:TH1和TH2。当二者分化平衡失调时,即可引发多种疾病的发生,尤其是对支气管哮喘和肺纤维化的发生、发展起到关键性作用。支气管哮喘和肺纤维化是呼吸系统的常见病,近年来发病率和死亡率逐年增高。现有研究认为支气管哮喘和肺纤维化发病的重要基础是TH1/TH2平衡失调、TH2细胞数目增多及功能亢进。因此促进TH0细胞向TH1细胞分化,抑制TH2型细胞因子的产生才是防治上述两种疾病的行之有效的策略。卡介苗(Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin, BCG)是用减毒结核菌制成的用以预防结核病的免疫制剂,应用于临床已有数十年的历史。近年来的研究表明BCG除能预防结核以外,还广泛应用于对肿瘤、呼吸系统疾病和变态反应性疾病的防治。BCG用于治疗支气管哮喘和肺纤维化时,可以刺激淋巴细胞增殖和TH1免疫反应,抑制TH2型细胞因子的产生,发挥较好的防治效果。但使用卡介苗后毒副作用较多,限制了其进一步广泛应用。因此近年来有关学者对从卡介苗中提取低毒高效成分产生了极大兴趣,如卡介苗的细胞壁骨架(Cell-Wall Skeleton from BCG, BCG-CWS)、多糖(Polysaccharide Nucleic Acid Fraction from BCG, BCG-PSN)等。但其DNA组分因一直被认为是一种免疫学惰性物质而备受冷落。直到1984年,Tokunaga等发现从BCG中提取的MY-1(含70%DNA和28%RNA)具有通过其自身结构特点直接触发机体免疫防御机制,显著增强TH1型细胞反应的能力,具有显著的抗癌活性而毒性很低。MY-1强有力的诱导TH1型免疫反应的能力向人们昭示BCG中的DNA组分(BCG-DNA)可能为BCG中主要的活性成分,具有显著的调节TH1/TH2平衡的能力,并有望对支气管哮喘和肺纤维化的防治发挥重要作用,对此目前尚无相关的动物或人体实验研究。本课题以这一研究思路为切入点,首先创立一种分离纯化BCG-DNA的方法,提取高纯度的BCG-DNA,然后建立小鼠哮喘模型和小鼠肺纤维化模型,通过观察BCG-DNA 对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cells, hPBMC)、小鼠哮喘模型和小鼠肺纤维化模型中相关细胞因子表达的影响;对小鼠哮喘模型和小鼠肺纤维化模型中气道和肺组织病理变化的影响;以及对人胚肺成纤维细胞增殖的影响,探讨BCG-DNA对TH细胞免疫的影响及其对哮喘和肺纤维化的防治作用。方法1 分离纯化BCG-DNA: 采用超声、加热、胰蛋白酶消化、离子交换和凝胶过滤层析方法,去除菌体蛋白和多糖,精制DNA。通过分析DNA含量和片段大小及检测蛋白和己糖含量进行产品的质量鉴定。2 检测BCG-DNA对TH细胞免疫的影响及其对哮喘和肺纤维化的防治作用 2.1 BCG-DNA对小鼠脾细胞和hPBMC TH1细胞因子产生的作用: 分别分离小鼠脾细胞和hPBMC,分别加入BCG-DNA和BCG-PSN,于37℃、5%CO2培养72小时,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养上清中的IFN-γ水平。2.2 BCG-DNA经DNase消化后对小鼠脾细胞和hPBMC TH1细胞因子产生的作用: 将BCG-DNA 以DNaseⅠ消化。分别分离小鼠脾细胞和hPBMC,分别加入BCG-DNA、DNase消化后BCG-DNA,于37℃、5%CO2培养72小时,ELISA方法检测培养上清中的IFN-γ水平。2.3 BCG-DNA气道内应用对哮喘小鼠过敏性气道炎症的影响: 以鸡卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏、激发小鼠,建立小鼠哮喘模型。于激发时向气道内分别滴入100μg BCG-DNA(BCG-DNA组)和100μg BCG-PSN(BCG-PSN组)。在鼻腔内滴入OVA之前,氯胺酮溶液(0.05g/ml)20μl腹腔内注射麻醉小鼠。最后一次激发24小时后颈椎脱臼处死动物,观察哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoaveolar lavage fluid, BALF)中白细胞(White blood cell, WBC)总数、嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)百分比,ELISA检测肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ的含量变化,常规病理切片观察小鼠肺内炎症情况,AB-PAS染色观察杯状细胞增生和粘液分泌情况。2.4 BCG-DNA气道内应用对博莱霉素(bleomycin, BLM)致小鼠肺纤维化的影响: 构建BLM致小鼠肺纤维化模型,于d0、d7、d14向气道内滴入100μg BCG-DNA(BCG-DNA组)。在鼻腔内滴药之前,氯胺酮溶液(0.05g/ml)20μl腹腔内注射麻醉小鼠。于d21颈椎脱臼处死动物,肺组织分别做HE染色和Masson染色,观察肺内炎症增生情况及胶原纤维增生情况,ELISA检测BLAF中IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ及TGF-β1的含量变化。实验设雷公藤甲素(triptolide, TP)治疗组作为对照组。2.5 BCG-DNA对人胚肺成纤维细胞增殖的影响: 分别以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、BCG-DNA+LPS及BCG-DNA与小鼠脾细胞共同孵育72小时,将各组细胞培养上清200μl分别加入96孔细胞培养板中预培养24小时的人胚肺成纤维细胞,采用四唑盐(MTT)比色试验,检测人胚肺成纤维细胞的增殖情况。数据均以均数±标准差( ±s)表示,采用SAS6.12统计软件,各组间均数采用方差分析,采用t检验,P<0.05为由统计学差异。结果1 纯化的BCG-DNA经紫外吸收检测符合核酸的标准吸收光谱,其中各成分的比例为: DNA95.3%, RNA0.5%, 蛋白0……   
[关键词]:卡介菌;基因组DNA;TH1/TH2;支气管哮喘;肺纤维化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北医科大学2004年
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