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核转录因子NFκB对APL细胞组织因子的调节及三七总甙影响的实验研究

李晓红

  基因表达调节由一个复杂的网络组成。基因调节主要在转录水平完成。不同的基因在不同类型的细胞被转录,并对不同的刺激产生反应,如激素、生长因子、应激、损伤、和炎症,调控细胞周期、细胞增殖、分化及细胞迁移、细胞之间的相互作用。研究显示转录因子在基因转录过程中起关键作用。近十年来的基因工程技术的巨大进步,使阐明转录因子的结构、信号转导途径、调控机制成为可能。1986年由Ranjan Sen 等人在B细胞中发现一种结合于免疫球蛋白κ轻链增强子上的核蛋白,命名为NFκB。进一步研究发现NFκB是一种重要的核转录因子,已有五个家族成员被克隆,存在于多种细胞,参与炎症、免疫、细胞增殖、细胞凋亡等多种生理、病理过程。近10年来,随着对NFκB研究的不断深入,人们发现大约有150种基因受NFκB调控。可以调控早期反应基因的表达,包括细胞与细胞之间的相互作用,细胞间的信息传递,细胞募集或迁移 ,早期发病信号的扩大或播散,起始及加速肿瘤的发生等等。与此同时,由于其在炎症、肿瘤发病中的重要意义,以NFκB作为治疗的靶点,研发新的治疗策略和治疗方法的工作受到越来越多的关注。目的:研究核转录因子NFκB对急性早幼粒细胞白血病组织因子的调控,通过核转录因子NFκB及其抑制因子IκB的表达探讨三七总甙对NB4细胞组织因子的调节机制,及三七总甙对NB4细胞组织因子mRNA水平、细胞膜表面抗原水平以及对NB4细胞诱导分化的影响,由此探索DIC新的治疗策略与方法。方法:1 细胞采集和培养:采集30例APL患者新鲜骨髓液及10例正常人外周血5ml,肝素抗凝,淋巴细胞分离液分离单个核细胞。急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞培养于含10%灭活胎牛血清(Gibco BRL),青霉素100U/ml及链霉素100U/ml的RPMI1640培养液中,于5%CO2,饱和湿度为100%,37℃培养箱中悬浮培养,每2-3天传代1次。实验用对数生长期细胞,胎盘蓝染色拒染率均在95%以上。三七总甙,储存液浓度100mg/ml,实验前用不含血清的RPMI1640培养液稀释至工作液浓度。2 RT-PCR检测TFmRNA及IκBαmRNA表达水平 TRLzol RNA提取试剂盒提取APL细胞及NB4细胞总RNA, 以M-MLV逆转录合成cDNA,引物设计与扩增参照文献。TF上游引物(575-594bp):5’- GAA GGA ACA ACA CTT TCC TA-3’,下游引物(788-765bp):5’-GG GCT GTC TGT ACT CTT CCG GTT A-3’, PCR扩增条件为94℃, 30s; 60℃, 30s; 72℃, 45s; 35个循环,72℃延伸10分钟,扩增片段长度213bp。IkBα扩增片段长度562bp,上游引物序列:5’-tattctccctaccagctcac-3’;下游引物:5’-cactcctggctgttacatgtcac-3’。扩增条件:94℃,40s,58℃,40s ,72℃,60s,30个循环。1.8%琼脂糖凝胶电泳(含EB5μg/ml),90V,40分钟,在紫外线灯下观察结果,读胶仪(AlphaImageTM 1220 & documentation Analysis System,Alpha Innotec Corporation,USA)扫描定量。3三七总甙对NB4细胞增殖抑制作用 将对数期生长的细胞悬液接种于96孔培养板,每孔200μl(细胞浓度2×105/ml),培养结束前6小时加入20μl MTT(5mg/ml),离心培养板10分钟,弃上清,加入200μl DMSO,振荡溶解甲替结晶,酶标仪(BIO-RAD ) 490nm 测吸光度A值,绘制细胞生长曲线。4 三七总甙对NB4细胞诱导分化影响 收集NB4细胞,离心,加终浓度为1.0mg/ml NBT和20ng/mlTPA,37℃孵育20min,离心涂片,瑞-姬氏染色,光镜下计数200个细胞,细胞内有蓝黑色斑为阳性,计数NBT阳性细胞百分率。细胞形态学: 细胞瑞-姬氏染色,光镜下观察细胞形态并照相。流式CD11b,CD14测定:收集200μg/ml处理第4天,第6天的NB4细胞,冷PBS洗两遍,加入CD11b,CD14抗体,孵育30min,流式细胞仪(FACSCalibur)检测。流式细胞术观察NB4细胞周期:取200μg/mlPNS处理72hNB4细胞及对照组NB4细胞1×106个,4℃、1000r/min离心5min,弃上清;细胞沉淀以1mlPBS洗2遍,75%乙醇固定,-20℃过夜;4℃、400×g离心5min,弃上清,细胞沉淀以1mlPBS洗2遍,加入碘化丙啶(20μg/ml)染色30min,流式细胞仪检测,CellQuest软件获取数据,ModFit LT 2.0软件进行细胞周期分析,计算G0-G1 期、S期及G 2-M期细胞百分比。5 三七总甙对NB4细胞促凝活性(PCA)影响:收集细胞,调整细胞浓度为1×107/ml, 取50μl细胞悬液加等体积健康人混合血浆(NHP, 含凝血因子, 包括FVII)于37℃孵育3min,再加入0.025M氯化钙50μl,记录凝固时间, 凝固时间越短,则PCA越高。6流式细胞术检测三七总甙对NB4细胞表面组织因子抗原影响: 三七总甙各处理组NB4细胞2mmol/LEDTA-PBS洗涤,10mmol/L-EDTA-PBS孵育20分钟,2mmol/LEDTA-PBS洗2次,FITC标记TF单抗4℃避光30min,PBS洗涤两遍,流式细胞仪(FACSCalibur)检测。7 Western blot检测NFκB及其抑制因子IκBα蛋白表达 提取三七总甙各处理组NB4细胞,分离单个核细胞,加入低渗缓冲液(临用前加DTT0.5mmol,,PMSF0.2mmol10μl,10%NP-40 10μl),振荡悬浮细胞,4℃冰浴15分钟,400g离心5min,(细胞核沉淀留用),取上清12000g再离心5分钟,上清液为细胞浆蛋白,置﹣30℃保存。考马斯蛋白定量法定量,检测细?……   
[关键词]:NB4细胞系;核转录因子NFκB;p65蛋白;NFκB抑制因子IκBα;组织因子
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:河北医科大学2004年