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盐生盐杆菌RM07片段的缺失分析及其启动活性的研究

王茵

  DNA片段RM07分离自嗜盐古菌—盐生盐杆菌R1染色体,该片段不仅在嗜盐古菌和酵母菌内具有启动子功能,而且在大肠杆菌中也具有启动活性。序列分析表明其上确实含有细菌启动子的-35、-10保守区。利用大肠杆菌启动子探针质粒pKK232-8,通过进一步的缺失分析、重组子抗性水平的检测以及氯霉素乙酰基转移酶活性的测定,证实该序列上的-35区和-10区的完整性确为其在大肠杆菌中具启动活性所必需:缺失了-35区只保留-10区的DNA片段RM07a的启动子活性大大降低近于零,说明-35区对于保证启动子的活性具有不可缺少的重要作用;而保留了-35区和-10区保守序列的DNA片段RM07b,虽然比RM07片段显著减小,但其启动活性不但未受影响,还有所提高,这暗示0.1kb的RM07b片段上、下游部分为非必需区,甚至可能在一定程度上是具有抑制作用的区域。RM07片段的序列分析表明除了-35、-10区外,其上还具有三个嗜盐菌启动子特征区域DPE,它们是与真核生物基因的启动子具有类似的启动子结构。用以egfp为报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1为载体,将RM07片段及其部分缺失的RM07c片段分别取代egfp上游的CMV启动子,构建重组质粒pEGFP-RM07、pEGFP-RM07c并转染CHO细胞。在倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测片段RM07和RM07c在哺乳动物细胞株中的启动活性。研究结果表明,它们均能在哺乳动物CHO细胞中启动其下游egfp基因的表达。以上研究结果首次从启动子片段的序列结构及其功能水平上证实来自嗜盐古菌的RM07片段在细菌和哺乳动物细胞中均具有启动活性,这对深入了解古菌的特性、进一步完善三域系统发育树以及揭示水平基因转移等现象具有特殊意义,表明RM07片段有可能成为构建双功能的表达载体的新的启动子资源。对不同生长条件下RM07片段启动活性的变化检测的结果表明一定的葡萄糖浓度、酸性pH值和高于通常的氯化钠浓度的培养条件下可提高RM07片段在大肠杆菌中起始CAI,(氯霉素乙酞基转移酶基因)转录的活性;低于通常的氛化钠浓度和碱性PH值的条件下,即使菌落的生长未受显著地抑制,而RM07片段的启动活性大大下降了。这些结果表明RM07片段在大肠杆菌中的启动活性是受环境因素调控的,特别是氯化钠浓度的提高具有明显的促进作用,这一特征也许更适合构建在高盐环境下高效表达的载体,以应用于某些环境污染处理。……   
[关键词]:盐生盐杆菌;RM07片段;启动活性;大肠杆菌;CHO细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:武汉大学2003年