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SCMV-CP基因克隆及遗传转化甘蔗研究

姚伟

  甘蔗花叶病(Sugarcane Mosaic Disease),是一种严重危害甘蔗生长的病毒性病害。病发时造成甘蔗大量减产。耕作措施、化学药剂等方法均起不到有效的防治作用,国内外研究证明,培育抗病品种是最经济、有效的防治办法。由于甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物,遗传背景非常复杂,其抗病性是受微效多基因控制的数量性状,抗病育种群体分离十分广泛,使得通过常规的育种手段很难将抗病性状与优良品质性状结合起来,植物基因工程为抗病毒育种开辟了新的途径。根据GENBANK已经公布的甘蔗花叶病毒亚组保守氨基酸序列,设计合成两端引物,用RT-PCR方法从高度感病品种Badila叶片中扩增得到了1.8 kb的预期目的片段,回收并纯化目的片段后,将其克隆于pMD-18-T载体上,测序结果表明我们所克隆的核苷酸序列由一个长为1581bp的开放阅读框(ORF)和231 bp长的3′末端非编码区序列(UTR)组成。ORF中包括病毒的完整外壳蛋白(Coat Protein,CP)序列及部分核内含体蛋白b(Nuclear Inclusion b,NIb)基因的C-端序列。与SCMV亚组中其它序列的分析比较,该病毒分离物的CP基因序列与SCMV-D株系同源性最高,达到了96.08%,其氨基酸同源性高达97.44%,其次是SCMV-A,核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为94.71%和96.81%。用基因枪(PDS-1000He)轰击法将含有甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因的质粒pNUSCP转化Badila的愈伤组织。共轰击了2251个Badila的愈伤组织块,在含有30 mg/L G418的选择培养基上进行抗性筛选后,得到53株再生植株。分子检测后有24株呈阳性,经Southern杂交分析验证,有13个株系中外源基因以多拷贝形式整合到甘蔗基因组中,并可稳定地遗传给亚无性系。对转基因植株亚无性系13个株系进行了网虫室抗病性试验,摩擦接种表明,除了B4和B31株系各有一株表现出轻微的发病症状外,其它均无发病症状出现,表现高度的病毒抗性,而对照组几乎全部发病。通过对转基因植株亚无性系叶绿素含量、光合参数、活性氧代谢有关的酶活性测定分析,结果表明转基因Badila由于外源CP基因的导入,病毒在植株体内无法正常复制繁殖,从而保护了植株细胞免受因病毒侵染造成的伤害。未转基因Badila接种后病毒迅速繁殖蔓延,受害叶片对活性氧清除能力下降,促使有毒物质活性氧的积累,启动膜脂过氧化,造成膜的损伤。……   
[关键词]:甘蔗花叶病毒;外壳蛋白基因;转基因甘蔗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2004年