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苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位

伍赠玲

  苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是研究最为深入、使用最为广泛的一种杀虫微生物,在生物防治中占有极其重要的地位。营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIPs)是一种在对数生长期分泌的活性蛋白,主要分为VIP1、VIP2和VIP3三类,其中,VIP3A对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性,甚至能毒杀一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫。几丁质酶能够分解作为真菌细胞壁和昆虫围食膜主要成分的几丁质,具有重要的生防价值。研究苏云金杆菌VIP3A、几丁质酶对开发Bt新资源、改良Bt制剂具有重要意义。Bt基因定位研究可以拓宽Bt杀虫谱,增强杀虫活性。确定了基因在基因组中的位置后,即可对该基因所在的质粒或染色体进行限制性酶谱的构建以及全序列的测定,有助于发现新的基因、研究基因之间的互作关系和表达调控机制。本研究对Dt编码VIP3A、几丁质酶的基因进行了克隆和定位。主要研究结果如下:一、对常规的三种提取Bt质粒DNA的方法进行了比较。煮沸裂解法提取的质粒DNA杂质多,只能作为粗略检测的模板;BGSC法适合于提取分子量较大的质粒DNA;用常规碱裂解法所得的质粒DNA条带不全,大质粒缺失,且重复性差,不适合作Southern杂交的模板DNA。本研究摸索出一种适合于提取Bt质粒的改良碱裂解法,该法提取的质粒DNA条带清晰、无拖尾,谱带齐全,且质粒DNA纯度高,产物可直接用于限制性内切酶消化、PCR扩增等分析,满足Southern杂交的对模板纯度较高的要求。二、克隆了WB50的vip3A基因并在GenBank上登录(登录号AY295778)。根据GenBank上已知的Bt vip3A基因序列(登录号:L48811),设计出扩增vip3A基因的一对含NotⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物VCL1/VCL2,以WB 50的质粒DNA为模板,利用PCR扩增出vip3A基因序列。将PCR产物纯化回收后连接到克隆载体pMD18-T上,用CaCl_2转化法导入到受体菌Escherichia coli JM109中,福建农林大学硕士学位论文摘要在x一gal、IPTG平板上挑选若干个白色菌落,进行限制性酶切和PCR分析,验证阳性克隆子并测序。测序结果经在线的Blast软件进行同源性分析表明:与其高度同源的基因均为人尸3A基因,同源性高达99%以上,该基因在GenBank上的登录号为AY295778。三、WB50菌株v动刘基因定位。WB50菌株的v勿3A基因是从质粒DNA中克隆得到的,初步推测viP剑基因定位于质粒上。为进一步验证此推测以及精确定位该基因,将质粒DNA各条带纯化、回收,PCR分别扩增F劫3A基因,结果表明,叮刀别基因不定位在小于23kb的质粒上。以染色体DNA为模板进行PCR扩增,未得到目的片段,确定染色体DNA不编码1材乡3A基因。以F动3A基因468 bp的片段作探针,对WB50的质粒和染色体DNA进行Southern杂交,结果表明,该基因定位于31.8 kb的质粒上。四、WB50菌株chi基因定位。本研究从Bt菌株wB50的总DNA和染色体 DNA中扩增出几丁质酶基因(chi),而用质粒DNA则无法扩增出该基因,将该基因初步定位于质粒外的遗传因子上。此外,采用chi基因片段作探针,对WB50菌株的DNA样品进行Southem杂交,进一步精确定位该基因在染色体上。……   
[关键词]:苏云金芽孢杆菌;vip3A基因;chi基因;基因克隆;基因定位
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2004年