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酿酒酵母耐盐基因HAL1的功能验证

李淑娟

  耐盐基因工程育种的一个十分重要的环节是分离耐盐相关基因,进行基因功能验证,为基因工程育种提供优良的基因资源。本研究利用从酿酒酵母菌株AS2.375中克隆出来的HAL1基因构建成的植物表达载体pAHF,通过三亲杂交转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中。用农杆菌介导的叶盘法将HAL1基因转入模式植物烟草,对转基因烟草的耐盐性进行评价;并进一步转化木本植物小黑杨(Populus simonii×P.nigra)花粉植株以期获得耐盐杨树新品种。主要研究结果如下:1.以烟草为实验材料,建立了较为理想的植株组培再生体系。烟草叶片诱导不定芽分化培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,生根培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA,卡那霉素的选择压为50 mg/L,在此基础上进行遗传转化。2.获得了烟草转化再生植株。经PCR扩增检测8个烟草转化子的再生苗,有6个获得约900 bp的特异性扩增谱带,初步证明HAL1基因已整合到烟草基因组中。3.耐盐试验表明,在被检测的900株烟草转化再生植株中有481株可在含NaCl0.80%~1.50%的生根培养基中生根,生根率为53.45%;而对照烟草植株在含NaCl0.80%的生根培养基中生根率为0,仅在低于0.80%NaCl的生根培养基中生根。4.对转基因烟草的自由授粉子代进行了子代测定。在含NaCl培养基中进行的种子萌发试验显示,转基因烟草子代种子幼苗的耐盐能力明显优于对照;PCR检测结果显示,外源基因仍存在于烟草子代的基因组中。5.通过卡那霉素抗性筛选试验,确定了小黑杨花粉植株遗传转化中卡那霉素的选择压。小黑杨叶片诱导不定芽卡那霉素的选择压为20mg/L,植株再生卡那霉素的选择压为50mg/L,生根选择压为30mg/L。6.获得小黑杨转化植株。PCR检测结果显示,10个转化子中有8个获得特异性扩增谱带。有待进一步验证和筛选。……   
[关键词]:小黑杨;烟草;HALI基因;遗传转化;基因功能验证;耐盐性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北林业大学2004年