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猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

黄海龙

  猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)均是由冠状病毒引起的以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征的两种传染病。目前,TGE和PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、ELISA和RT-PCR法等。随着分子生物学技术的不断发展,ELISA和RT-PCR法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。本研究所用TGEV和PEDV可在PK15细胞中大量增殖。在PK15细胞上分别培养TGEV和PEDV,待70%细胞出现CPE时收毒。应用Reed-Muench法测得TGEV和PEDV的TCID_(50)。结果为:TGEV的TCID_(50)为10~(-4.8)/0.1mL。查反对数得63095,即该TGEV液63095倍稀释液0.1 mL等于1个TCID_(50)。PEDV的TCID_(50)为10~(-4.2)/0.1mL。查反对数得15849,即该PEDV液15849倍稀释液0.1 mL等于1个TCID_(50)。又在Genbank中查出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,结合两种病毒基因组结构特点,在对两种病毒基因序列进行同源性比较的基础上,选择二者的S蛋白基因为引物设计区。根据多重PCR引物设计原则,应用Primer5.0软件设计了TGEV和PEDV各两条引物。其中,TGEV的引物可扩增出426bp的特异片段,PEDV的引物可扩增出584bp的特异片段。经过引物浓度和MgCl_2浓度滴定、退火温度确定等PCR反应条件的优化,确定TGEV和PEDV单项RT-PCR体系的最佳条件分别为,引物浓度:TGEV 0.8-1.6μmol/L、PEDV 0.4μmol/L;MgCl_2浓度:TGEV为2mmol/L,PEDV为2mmol/L;退火温度:TGEV为54℃,PEDV为52℃-54℃。经敏感性试验确定,TGEV RT-PCR可检测0.63 TCID_(50)的模板,PEDV RT-PCR可检测1.6 TCID_(50)的模板。在此基础上,经PCR反应条件的优化,建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR,其最佳系统组成为,引物浓度:TGEV为0.6μmol/L,PEDV为0.4μmol/L;MgCl_2浓度为2mmol/L,dNTP浓度为100μmol/L。最佳循环条件为:94℃1min→56℃50s→72℃1min,35个循环,最后72℃延伸10min。本试验建立的TGEV和PEDV的二联RT-PCR可在同一反应中,同时扩增出这两种病毒不同大小的两个特异性核苷酸片段,以建立的二联RT-PCR扩增其它对照病毒未见阳性反应。并确定该二联RT-PCR可检测TGEV6.3TCID_(50)的模板,PEDV15.8TCID_(50)的模板,比单项RT-PCR的敏感性分别下降了一个数量级。用建立的二联RT-PCR方法对50份临床采集病料进行检测,检出TGEV8份,PEDV3份。TGEV占被检病料的16%,PEDV占被检病料的6%。同时,所检病料中发现1份TGEV和PEDV混合感染,证实在临床病例中有TGEV和PEDV的混合感染存在。吉林农业大学硕士学位论文TGEV和PEDV二联RT一PCR方法的建立及初步应用初步应用证明,该二联RT一PCR具有良好的敏感性和特异性。本研究为这两种疾病的临床诊断提供进一步可借鉴的方法,具有着潜在的应用价值。……   
[关键词]:猪传染性胃肠炎病毒;猪流行性腹泻病毒;诊断;二联RT-PCR;初步应用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2004年