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MDM2-p53反馈环对卵巢癌细胞药敏性的影响及机制

倪虹

  [目的]:卵巢癌是恶性度最高的妇科肿瘤之一,其病死率居妇科肿瘤之首,严重威胁着妇女的健康和生命安全,其治疗以手术和化疗为主,但晚期卵巢癌五年生存率仍低于30%,导致卵巢癌化疗失败的主要原因是卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药性。顺铂耐药与否,患者的平均生存时间和复发率有显著差别。提高卵巢癌的化疗敏感性,降低化疗耐药尤其是对最常用的化疗药物顺铂的耐药性是改善临床预后的关键,因此,从基因水平寻求新型有效的治疗方案是当今肿瘤研究的热点。对卵巢癌的耐药正在研究中,其机制非常复杂,许多因素可在不同的细胞水平参与耐药的发生,许多改变可在高度耐药的卵巢癌细胞中同时出现。MDM2(murine double minute 2)最早发现于鼠3T3成纤维细胞系,它能导致此细胞系的自发转变。后来在一系列人类肿瘤组织中发现其表达,人类MDM2定位于12q13-14,其表达的调节相当复杂,并且有不同的mRNA剪切形式。目前至少已发现7种不同的mdm2mRNA和5种mdm2蛋白(P90,P85,P76,P74,P57)。30%的肉瘤有MDM2的扩增,约5%~10%的人类肿瘤有MDM2的过表达。MDM2是p53的下游调节基因之一,它引起MDM2转录激活,MDM2反过来抑制p53活性,二者形成一个自动调节反馈环,以保持正常情况下p53处于低水平状态。这一机制受多种基因、多种因素的调节。越来越多的研究证实,MDM2-p53自调节环异常不仅在肿瘤发生、发展中有重要作用,而且与肿瘤治疗有着密切的关系。关于p53与肿瘤药敏性的关系已进行了广泛的研究,研究的结果也不尽相同,有的研究认为二者有关,有的认为二者无关,有的认为p53可增加细胞的药敏性,有的结果认为p53会降低细胞的药敏性。相比之下,MDM2与细胞药敏性的关系研究的不多,但由于MDM2与p53的相互调节关系,MDM2对细胞生物学行为调节的机制就显得颇为引人注目。天津医科大学博士学位论文[方法及结果】:本研究首先将含全长人类MDMZ的真核表达载体PCMV一MDMZ及其对照空载体PCMV转入人卵巢癌细胞系A2780和SKOV一3,其中A2780的p53为野生型(WT一P53),而SKOV一3缺乏p53基因转录与翻译,检验MDMZ对此两株p53状态不同的细胞系的药敏性的影响。为了解MDMZ是否到达有效表达程度,我们对转染前后的A2780卵巢癌细胞系进行Co60放射冲击,用West的印记法检验其p53蛋白的表达情况。我们的实验证实未转染MDMZ和转染了空载体的A2780卵巢癌细胞系在受到放射冲击后,有p53表达,而转染了MDMZ的A2780由于MDMZ对p53的抑制作用,无p53表达,由此证实我们转染的MDMZ已到达有效表达水平。在SKOV一3,未转染前,无MDMZ表达,转染后可见MDMZ高表达。在此基础上,我们对转染前后的细胞分别行台盼蓝实验、集落形成实验、MTT法测定细胞的ICS。值等检验细胞药敏性的改变,结果是A2780-MDM2在给予顺铂治疗后每个时间点的台盼蓝阳性细胞百分比较对照组增加;A2780一MDMZ的细胞集落形成数明显低于A2780及A2780一V组(P<0.01);A2780的ICS。为13.54士1.53娜01,和A2780一V比较,差异无显著性。A2780一V的ICS。为15.14士1.39林mol: A2780一MDMZ的ICS。为6.28士1.02卿01;两组比较,差异有极显著性(p=0.001);而SKOV一3在MDMZ转染前后没有台盼蓝阳性细胞百分比、细胞集落形成数、ICS。等有意义的改变,以上结果证明MDMZ的转入增加了A2780卵巢癌细胞对顺铂的药敏性,而在无P53表达的SKOV一3细胞MDMZ却不发挥作用,提示虽然MDMZ有许多不依赖p53的作用,但它不能单独对卵巢癌细胞的药敏性发生影响,它必须通过MDMZ-p53反馈环而发挥作用。为探讨此药敏性发生改变的机理,我们通过流式细胞技术检测A2780的细胞周期,A2780一MDMZ细胞在给以顺铂治疗后,G、期明显缩短,而S期明显延长,从而使已受顺铂损伤的卵巢癌细胞进入S期而导致死亡,因而对顺铂的敏感性增加。A2780在给予顺铂治疗后,出现了明显的G:期阻滞,这使受到顺铂损伤的细胞在进入关键的M期前修复,因2天津医科大学博士学位论文而降低了顺铂对A2780卵巢癌细胞的杀伤作用。顺铂发挥杀伤肿瘤细胞的作用机理是导致细胞内顺铂一DNA复合物的形成和通过使DNA链内和双链之间的缠绕变形而导致损伤,而这种损伤主要由p53介导的核昔酸切除反应(nueleotide exeision repair,NER)修复,因此我们利用原子吸收光谱仪测定宿主细胞重激活实验DNA中的铂量以进行1〕NA一顺铂结合及修复检测、(HCR)等直接测试在转染了MDMZDNA修复是否降低了。首先我们观察了A2780一MDMZ和的细胞中,A2780一V细胞DNA的铂结合量。在顺铂作用2小时,结合量相似,即二者的顺铂吸收率相同。然而在随后的时间点A2780一MDMZ的顺铂~DNA结合量较A2780一V增加更多,提示八27科0-MpMZ的训八切除修复反应失活,顺铂得以与A2780一MDMZ细胞的DNA结合,因而使细胞无法进行复制和分裂。由于顺铂导致的DNA损伤会显著阻滞RNA多聚酶n的转录过程,因此,编码了某种酶(氯霉素……   
[关键词]:卵巢癌;基因治疗;癌基因;抑癌基因;MDM2基因;p53基因;A2780细胞;SKOV-3细胞;耐药性;细胞周期
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津医科大学2004年
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