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应用抑制消减杂交技术研究外周血嗜酸细胞支气管哮喘相关基因的差异表达

徐劲松

  支气管哮喘是一种以气道阻塞和气道高反应性为特征的气道炎性疾病,目前普遍认为嗜酸细胞尤其是低密度嗜酸细胞属于引起迟发相哮喘反应和气道高反应性的关键细胞。由于以嗜酸细胞浸润为主的变应性炎症是支气管哮喘的主要病理特征,因此,曾经有学者又将哮喘称为慢性脱屑性嗜酸细胞增多性气管炎。同时,支气管哮喘是一组多因子、多基因疾病。可能存在一种或数种基因,此基因能决定个体是否发生哮喘;其次,某些基因可能影响个体对哮喘危险因素的易感性。这些基因可能由先天遗传获得也可能是后天与环境因素的相互作用中由基因突变而形成。随着人类基因组计划的完成,研究基因的功能及其表达方式显得日益重要。因此研究支气管哮喘在疾病发作期嗜酸细胞差异表达的基因,具有十分重要而现实的科学意义。目的:应用抑制消减杂交(Supression Subtractive Hybridization SSH)技术探讨支气管哮喘病人嗜酸细胞基因的差异表达,力求在基因水平阐明支气管哮喘的发病的本质。方法:选择典型的支气管哮喘病人,在治疗前后取外周血并用不连续密度梯度法分离其嗜酸细胞。分别提取嗜酸细胞的总RNA,利用以RT—PCR为基础的SMART~(TM)技术合成cDNA,酶切后分别连接不同的接头,进行两步消减杂交、两轮PCR来扩增差异表达的基因片断,构建消减cDNA文库,使用differential screening技术对所构建的文库进行筛选,鉴定阳性克隆并测序,登陆GeneBank进行同源性比对。对部分有意义差异表达的基因进行Virtual Northern Blot分析。结果:分别从支气管哮喘患者发作期和缓解期的外周血中分离了高纯度的嗜酸细胞,并提取了高质量的总RNA,完整的反转录为全长cDNA。RaS工酶切彻底,获得了长度均一性良好的短片断。高效率连接特定的接头,成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库,经检测消减效率较高。巢式PCR扩增特异性高,使差异表达基因得到了指数扩增。PCR产物连接T载体,并成功转化DHSQ大肠杆菌,使文库中差异表达的基因得到有效的分离。从上调表达的消减文库中初步选取96个克隆进行筛选,利用Differentia1S。reening鉴定后确定15个克隆含有差异表达基因。测序获得12个差异表达的基因。测序结果递交GeneBank进行同源性对比分析,确定差异表达的基因编码的蛋白。对其中4个基因进行Virtual Northern Blot分析,差异表达的基因得到进一步的证实。结论:以微量总RNA为模板利用SMARTTk技术合成cDNA,解决在有限起始物的情况下需要合成足够量cDNA进行SSH的矛盾。成功应用抑制性消减杂交技术研究支气管哮喘患者外周血嗜酸粒细胞哮喘相关基因的差异表达,构建了外周血嗜酸粒细胞支气管哮喘相关基因的cDNA消减文库。发现了TAKI编码基因、环磷酸核昔酸门控通道编码基因、ATP合成酶F6亚单位编码基因、细胞色素C亚单位工和H编码基因、辅酶HD环DAN融合蛋白编码基因、ATP合成酶F0亚单位6、富组胺肌浆网钙结合蛋白编码基因、DAZ关联蛋白2编码基因、骨肉瘤甲状旁腺反应D1蛋白编码基因、在恶性黑色素瘤中差异表达的mRNA、和线粒体AsgY基因组基因等12个差异表达的基因。间接证实了在支气管发作期嗜酸细胞编码炎症介质、细胞信号传导、能量代谢和细胞凋亡相关基因的上调表达。采用地高辛标记的探针替代传统的differential screening技术的同位素畔一dCTP探针,在继承其高度灵敏和良好特异性的基础上避免放射污染,简化使用操作。……   
[关键词]:支气管哮喘;抑制消减杂交(SSH);嗜酸细胞;基因;转化生长因子β激活激酶;环磷酸核苷酸门控通道
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第一军医大学2004年