手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

应用RNAi抑制乙型肝炎病毒复制和表达的研究

王玥

  乙型肝炎病毒(HBV)感染是急慢性肝炎的主要原因,并与肝纤维化和肝细胞癌的发生密切相关。全世界约有3.5亿人感染该病毒,其中近15-25%的病人将死于该病的并发症。乙肝重组疫苗的推广使用使乙肝免疫预防取得重大突破,但治疗上仍缺乏理想的抗病毒药物。在乙型肝炎基因治疗的探索中,应用反义寡核苷酸、核酶以及脱氧核酶(DNAzyme)的技术研究屡见报导,但各自存在较多问题有待解决。HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA(dsDNA)分子,具有逆转录病毒的特性,其3.5kb前基因组RNA既是DNA合成的模板,又是指导蛋白质合成的模板。HBV基因组高度重叠,因而针对HBV某一靶位点切割病毒的mRNA和前基因组RNA,可以有效阻断病毒蛋白质合成。RNA干涉(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默(PTGS)过程中,与双链RNA有同源序列的单链RNA(如mRNA)被降解,从而阻断基因表达。RNAi可介导相关基因特异性降解的特点,使其有望成为针对病毒基因,肿瘤基因以及疾病相关基因的一种基因治疗手段。RNAi过程的关键是由双链RNA切割产生21-23nt长的小干涉RNA(siRNA),siRNA可介导对靶mRNA特异性的降解。直接合成siRNA用于哺乳动物细胞,可避免使用长的双链RNA(>30nt)所产生的非特异抗病毒反应。随着制备小干涉RNA的技术进步,RNAi用于抑制病毒感染的研究也取得一定进展,包括脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒以及流感病毒等在内的病毒感染均可被特异性双链RNA抑制其复制和表达。而近来的研究显示,RNAi也可以在转录后水平上抑制HBV的复制和表达。HepG2.2.15细胞系模拟了一种HBV已经感染并且HBV基因组整合到宿主细胞基因组中的状态,能够再现HBV的复制和表达,是一种用于抗HBV治疗研究的实验工具。应用PCR制备的siRNA表达框架体系(SECs)在此细胞系水平上进行RNAi抗病毒的研究国内外至今未见报道。本实验针对HBV S区、preC/C区设计合成siRNA表达框架体系在HepG2.2.15细胞内转录产生HBV特异性siRNA,观察siRNA在蛋白和核酸水平上对HBV表达和复制的抑制作用,为应用siRNA控制HBV感染提供理论依据。实验中针对HBV S区、preC/C区设计合成引物进行PCR扩增,测序后根据该序列选择4个靶位点,设计合成siRNA表达框架体系的4对下游引物,PCR扩增后产物纯化并转染HepG2.2.15细胞,转染后不同时间观察该HBV siRNA产生体系的抗病毒效应,并筛选出具有最佳干涉效果的HBV siRNA产生体系,观察不同浓度、转染后不同时间该体系对HBV复制和表达的抑制作用。同时针对与HBV无任何同源性的序列设计产生siRNA表达框架体系,作为随机对照。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV siRNA产生体系及随机对照对HBV蛋白表达的影响;Western blot 检测siRNA对荧光素酶基因表达的影响;斑点杂交法检测siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV DNA水平的影响。所得结果如下:1、HepG2.2.15细胞病毒抗原分泌规律:HepG2.2.15细胞接种后第1天在培养液上清中即可检测到抗原分泌,随着培养时间延长,病毒抗原分泌量逐渐增加,到接种后第7-8天达到高峰,此后抗原分泌逐渐稳定。2、HBV S区、preC/C区测序结果:经与Gene Bank中HBV序列进行BLAST比对,HepG2.2.15细胞中的HBV基因序列为ayw1亚型。3、HBV siRNA产生体系对病毒蛋白表达的特异性抑制作用:与对照组(未加入脂质体仅加入PCR产物的HepG2.2.15细胞)相比,设计合成的4个HBV siRNA产生体系中的3个(SECs-S1,SECs-S2,SECs-C1)使HepG2.2.15细胞培养液中的HBsAg和HBeAg分泌水平不同程度下降,3个体系抑制HBV表达的作用由强至弱为:SECs-S2>SECs-S1>SECs-C1。其中靶序列位于HBV基因S区第458-478bp核苷酸序列的体系(SECs-S2)对蛋白表达的抑制作用最明显,在转染后第6天细胞培养上清液中检测不到HBsAg分泌,而对HBeAg分泌的抑制率达64.78%。HBV siRNA产生体系SECs-S1同SECs-S2的抑制作用接近,而SECs-C1的抑制作用低于前二者,转染后第6天对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率分别为74.88%和15.20%。以上结果提示,针对HBV S区的siRNA表达框架体系对HBV抗原分泌的抑制作用强于针对HBV preC/C的siRNA表达框架体系的抑制作用。3个HBV siRNA产生体系对HBsAg的抑制作用大于对HBeAg的抑制作用,对HBsAg的抑制率最高可达100%,而对HBeAg的最高抑制率为64.78%。SECs-C2和随机对照SECs-CON对抗原分泌的影响很小甚至没有。根据以上结果选择SECs-S2继续进一步的实验。4、Western blot检测培养细胞中的荧光素酶表达水平变化:结果显示,各个细胞培养孔之间荧光素酶表达水平相同或接近,提示细胞之间转染效率大致相同,siRNA表达框架体系对HBV基因表达的抑制作用,即HBsAg和HBeAg分泌水平的下降并非来源于转染效率的影响;同单独转染荧光素酶质粒的细胞中荧光素酶表达水平相比,siRNA表达框架体系(SECs-S2、SECs-S1、SECs-C1、SECs-C2以及SECs-CON)对荧光素酶的表达没有影响。5、SECs-S2剂量相关性抑制作用:在PCR产物0.5-2.0ng/ul的浓度范围内,SECs-S2对HBV基因表达的抑制?……   
[关键词]:RNA干涉;乙型肝炎病毒;小干涉RNA;基因治疗;HepG2.2.15细胞
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2004年