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新月弯孢霉甾体11β-羟基化与细胞色素P450酶的研究

卢文玉

  本论文重点研究了新月弯孢霉细胞色素P450酶与甾体11 β-羟基化的关系,氢化可的松高产菌株的选育,发酵工艺条件优化,适宜的底物投料方式以及流加H_2O_2对甾体转化的影响等。主要研究内容和结果如下:[1] 改进了检测氢化可的松及其相关产物的高效液相色谱法。建立的适宜高效液相色谱条件为:Phenomenex Prodigy Silica(5μm,250mm×4.6mm i.d.)硅胶吸附色谱柱,流动相为二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(体积比385:60:30:2),检测波长242nm,流速0.8mL/min。该方法准确,灵敏,重现性好,15min完成一个分析过程。[2] 确立了新月弯孢霉原生质体的适宜形成与再生条件:将培养22h的菌丝用0.3mol/L的二硫苏糖醇处理20min,0.6mol/L的KCl作为渗稳剂,30℃条件下经0.5%新生酶234和1%纤维素酶混合液(pH5.6)酶解3h,原生质体释放量达到7.76×10~6个/mL,再生率为23.07%。再生菌株菌落形态不变,保留了甾体11 β-羟基化能力。[3] 通过CO差光谱法检测到新月弯孢霉原生质体中存在细胞色素P450酶。苯巴比妥钠和邻苯二甲酸异辛酯对P450酶具有诱导作用。酮康唑对P450酶具有抑制作用。证实了P450酶是胞内酶。P450酶含量与氢化可的松的生成具有正相关性。[4] 采用亚硝基胍和紫外线复合诱变,结合酮康唑抗性筛选法,选育出氢化可的松高产菌株KA-91。RSA投料浓度为1.0g/L时,在未优化条件下发酵72h,氢化可的松转化率达到63.05%,氢化可的松对RSA的收率达到53.3%。将菌株KA-91连续5次转接斜面,发现菌株遗传性能稳定。结合试验结果,对诱变育种的机理进行了简要分析。推测新月弯孢霉产生酮康唑抗性可能是由于14α-脱甲基酶P450超量表达所致。[5] 证实了底物RSA对P450酶具有诱导作用。在分析底物RSA诱导P450酶表达的基础上,结合pH值对P450酶诱导和氢化可的松产生的影响,提出了生产氢化可的松的新发酵工艺:菌体生长至16h投入0.3g/L的RSA,培养至24h补加0.7g/L的RSA,继续培养至32h,调节pH值至6.5,以后每12h调节一次pH,发酵周期72h。[6] 分别考察了有机溶媒法、表面活性剂吐温80分散法、高聚物硅酮乳化法、超声波振荡法以及β-环糊精包结法等处理底物对甾体转化的影响。最终确定了适摘要宜的底物投料方式:向底物RSA与1 .2%吐温80的混悬液中加入p一环糊精(与RSA摩尔比为l:1),湿热灭菌20min投料。I7]确立了KA一91生产氢化可的松的适宜摇瓶分批发酵条件:培养基(岁L):葡萄糖22.5,牛肉膏5.5,酵母膏5.0,KHZPO43.O;装液量30mL/2 50mL三角瓶;摇瓶转速0一6h:160 r/min;6一72h:加or/mln;发酵温度28℃;发酵周期72h。采用改进工艺和适宜投料方法,RsA投料浓度为1 .0留L时,氢化可的松转化率达到74.88%。以适宜摇瓶分批发酵条件为基础,对氢化可的松高产菌株KA一91进行了7L罐分批发酵试验,发酵周期68h,RsA投料浓度为1 .09几时,氢化可的松转化率达到77.92%。18]探讨了1 lp一经基化过程中流加过氧化氢对氢化可的松产生的影响。摇瓶实验表明流加过氧化氢可以提高氢化可的松的产量。分析了流加玩02促进凿体转化的机理为:(l)改善传质过程,提供分子底物氧;(2)诱导细胞色素P450酶的表达,促进代谢酶活力;(3)通过更有效的P450酶代谢过程—HZO:旁路途径进行幽体底物的无氧氧化。本论文在幽体转化领域的创新之处在于:111首次结合酮康哇抗性筛选法,采用亚硝基肌和紫外线复合诱变选育氢化可的松高产突变株。该筛选方法快速有效,最终筛选到一株高产酮康哇抗性突变株KA一91,底物投料浓度1.og/L时,氢化可的松转化率63.05%,氢化可的松对RSA的收率为53.3%。121证实了P450酶在新月弯抱霉街体转化中具有关键作用,基于底物RSA、pH值对P450酶的诱导和氢化可的松产生的影响,提出了生产氢化可的松的新发酵工艺。131在幽体11p一轻基化过程中流加HZO:可以提高氢化可的松的转化率。……   
[关键词]:新月弯孢霉;甾体;氢化可的松;检测;酮康唑抗性筛选法;菌种选育;发酵条件;原生质体;细胞色素P450酶;溶解性;过氧化氢
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津科技大学2004年
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