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L-缬氨酸高产菌的选育及其发酵条件研究

赵丽丽

  本论文根据代谢控制发酵和代谢流分析理论,研究了L-缬氨酸高产菌选育及其发酵条件。主要研究内容和结果如下:(1)应用“纸层析—色斑洗脱比色法”和“化学比色法”对发酵液中L-缬氨酸进行了定量分析研究,确立了L-缬氨酸定量测定条件和计算方法。以高速氨基酸分析仪测定结果为参比,用化学比色法测定结果的准确度比纸层析—色斑洗脱比色法高,且应用化学比色法测定L-缬氨酸的含量较为方便。(2)确定了黄色短杆菌TV10原生质体紫外诱变的最佳条件,以黄色短杆菌TV10为出发菌株,经原生质体紫外和硫酸二乙酯(DES)多次诱变处理,摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,最终筛选出一株带有目的遗传标记的L-缬氨酸高产菌TV2564(Leu~-+Ile~-+2-TA~r+SG~r+α-AB~r)。该菌株在未优化条件下发酵72h,产L-缬氨酸29.30g/L。经验证,菌株TV2564的遗传性能稳定。(3)研究了菌株TV2564的摇瓶分批发酵条件。应用神经网络和遗传算法优化出种子培养基,并研究了种子培养条件;在发酵培养基单因素影响试验研究的基础上,应用Plackett-Burman设计试验法筛选出3个主要因素,进而运用响应曲面分析试验法确定了这3个重要因素的最佳水平,并研究了发酵培养条件。在优化条件下,菌株TV2564摇瓶分批发酵72h,产L-缬氨酸39.5g/L。(4)构建了L-缬氨酸生产菌TV2564的代谢网络,依据代谢流分析原理,应用MATLAB线性规划计算得到了L-缬氨酸生产菌不同发酵时期的代谢流分配。通过分析葡萄糖经EMP、HMP与TCA循环以及关键性节点GLC6P、PEP和PYR的代谢流分配,为发酵过程控制提供理论指导。(5)以摇瓶分批发酵最优条件为基础,对菌株TV2564进行了5L发酵罐分批发酵试验。根据5L发酵罐中溶氧变化情况,结合发酵过程的动力学分析及发酵过程中代谢流分配的特点,提出了分阶段供氧的控制模式,并加以试验验证,发酵64hL-缬氨酸的产量就达到45.1g/L。以5L罐分批发酵试验数据为依据,利用神经网络对L-缬氨酸分批发酵动力学进行了初步研究,建立了菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学模型,拟合模型较好地反映了L-缬氨酸分批发酵过程。(6)以分批发酵最优条件为依据,对菌株TV2564进行了补料分批发酵研摘要究。摇瓶补料分批发酵的初糖浓度为809几,于发酵过程第24h、36h、48h、60h分四次补加补料液,发酵70h产L一撷氨酸42.29几。在此基础上进行了SL发酵罐补料分批发酵试验。由于采用补糖补氨工艺,发酵60h产L一撷氨酸50.719几,分别比摇瓶补料分批发酵和SL罐分批发酵提高了20.16%和12.43%。本论文在L一撷氨酸代谢控制发酵研究领域的创新之处在于,首次将原生质体紫外诱变技术应用于L一撷氨酸高产菌的选育,并且选育出一株L一撷氨酸高产菌TV2564,采用补料分批发酵工艺,发酵60h可产L一撷氨酸50.71叭,达到国内先进水平。构建了L一撷氨酸生产菌的代谢网络,依据代谢流分析理论,得到了L一撷氨酸生产菌不同发酵时期的代谢流分配。通过对节点及代谢流分析,为以后的发酵控制提供理论指导。以发酵过程溶氧的变化为依据,结合动力学分析,提出了分阶段供氧的控制模式,并将神经网络用于动力学模型的构建,对L一撷氨酸发酵法工业生产的过程控制优化具有较强的指导意义。……   
[关键词]:L-缬氨酸;黄色短杆菌;诱变育种;代谢流;分批发酵;神经网络;补料分批发酵;发酵动力学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津科技大学2004年