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草鱼病原菌三元融合子构建及生物学特性研究

陈光荣

  采用细胞融合技术首次构建草鱼烂鳃病、赤皮病和肠炎病的病原菌融合子。应用多种经典检测方法对融合子的形态、构造、生理生化特性、致病性、抗原性和DNA同源性展开深入研究,以揭示融合子生物学特性的遗传规律。建立多元细胞融合技术,为研制鱼类细胞融合疫苗,创造有多种价值的益生菌等优良菌种资源提供科学依据。应用定性和定量药物敏感性试验与诱变相结合,筛选出荧光假单细胞56-12-10菌株的遗传标记为链霉素抗性,二元融合子AM-1菌株的遗传标记为环丙沙星抗性。在这两种细菌原生质体融合试验中,选择培养基中链霉素的应用浓度为300Iu/ml,环丙沙星应用浓度为100Iu/ml。在酶解温度37℃下,选出最适酶解时间为60min,最适溶菌酶浓度为5mg/ml。以PEG为促融剂的条件下,荧光假单细胞56-12-10菌株与二元融合子AM-1菌株的原生质体进行了融合,56-12-10菌株的原生质体形成率为81.6%,原生质体再生率19.8%,AM-1菌株的原生质体形成率为79.2%,原生质体再生率为8.2%,初筛的原生质体融合率为6‰,点种100个初筛融合子菌落在双抗培养基上连续传代10次,得到1个稳定的融合子菌落,其稳定率为1%;同时制得三者的原生质体并悬浮,先取其中58-20-9菌株、G_4菌株的原生质体进行融合,再将56-12-10菌株的原生质体与此二元融合原生质体液混匀并进行第二次融合,经单抗选择培养基上的筛选率约为3.5‰,而经过连续传代10次后,共得到两个菌株,其中一个菌株为特殊变异株,另一为稳定三元融合子。两种方法均可获得相同的稳定三元融合子,后者更为快捷。筛选的融合子菌株菌体短杆状,近于AM-1亲本株,平均长轴4.52μm,平均短轴0.75μm,平均体积1.33μm~3,革兰氏阴性,有鞭毛,运动,巨大菌落圆形,表面光滑、湿润,半透明,边缘整齐。对融合子菌株进行酶类性状及生理生化鉴定,其介于三原始亲本菌株之间。用融合子菌株对当年健康草鱼种进行人工感染攻毒,说明融合子菌株也具有致病性,进一步剖检病死鱼,发现由融合菌株攻毒的草鱼种具有肠炎病、烂鳃病及赤皮病三种疾病的部分症状。对融合菌株进行抗原性研究,结果表明,受融合子菌株免疫保护的草鱼种注射56-12-10菌株、AM-1菌株及三原始亲本,其免疫保护率分别达64.9%、68.0%、62.5%,抗体效价最高达1:256和1:512。对融合子及其亲本的DNA含量进行测定及琼脂糖凝胶电泳分析,融合子的DNA含量明显高于任一亲本。至于基因具体整合及表达情况,有待于进一步试验。……   
[关键词]:肠型点状气单胞菌;鱼害粘球菌;荧光假单胞菌;细胞融合
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:湖南农业大学2004年