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乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在苹果和番茄中的转化与表达研究

娄晓鸣

  本文以乙肝表面抗原大蛋白S1S2S为目的基因,构建了由番茄2A11果实特异启动子控制PRS-S1S2S基因表达的植物双元载体pYF9616;以苹果叶片为受体材料,通过研究影响农杆菌介导苹果遗传转化的因素,确立了红爱佳和凉香季节叶片高效再生和转化体系,获得了能正常转录和表达S1S2S基因的转基因苹果和番茄。实验内容和结果如下。1.植物表达载体的构建从番茄品种强力米寿的总DNA中克隆番茄果实特异启动子2A11,通过PCR方法合成乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因,在其3,端引入一段内质网滞留序列(SEKDEL),5,端引入烟草分泌信号肽序列(PR-S),构成带分泌信号肽及内质网滞留序列的乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S,并完成全序列测定。再构建由番茄2A11果实特异启动子控制PRS-S1S2S基因表达的植物双元载体pYF9616。2.苹果叶片高频再生和转化系统的建立通过分析不同细胞分裂素、不同固化剂、继代培养时间、暗培养时间、叶片极性、CH浓度对苹果叶片再生的影响,确立了苹果两品种再生系统。红爱佳添加7DZ1mg/L,NAA0.1mg/L的MS培养基,以近轴面接触培养基,经15-20天的暗培养获得再生频率100%的再生系统,凉香季节宜TDZ2mg/L,NAA0.1mg/L的MS培养基,其它条件同红爱佳,获得95.2%的再生频率。研究了Km选择压、Cb浓度、农杆菌浸染时间、共培养时间等遗传转化的必要条件,确立了苹果两品种的转化体系:红爱佳以MS培养基添加TDZ1mg/L,NAA0.1mg/L,凉香季节MS培养基中添加TDZ2mg/L+NAA0.1mg/L为基本培养基,外植体经农杆菌浸染5min,共培养2天,再进行红爱佳Km12.5mg/L,Cb250mg/L或凉香季节Km6.25mg/L,Cb250 mg/L的选择培养,经1-2次筛选,以获得抗性芽。3.转基因苹果、番茄的鉴定,目的蛋白的定量,金免疫电镜观察利用优化的转化体系,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳、凉香季节和番茄中,得到了抗卡那霉素抗性的GUS阳性转化植株。GUS染色阳性的转基因苹果经PCR扩增及RT-PCR检测证实S1S25基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,EILSA检测证明在苹果中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白.根据El LsA定童结果,苹果叶片最大表达童为1 1.180ng/g鲜重.番茄成熟果实最高表达童为523.53呵g鲜重,是叶子等其它器官表达量的110一285倍,实现了果实特异的高表达童.对转基因苹果叶片和番茄成熟果的蛋白初提液进行金免疫电镜观察,证实转基因苹果和番茄具有自我组合抗原蛋白的能力,观察到了和人血清中HBsAg、酵母中表达的重组HBsAg大小相近的平均直径为22nm左右的HBs人g颗粒.……   
[关键词]:苹果;番茄;S1S2S基因;根癌农杆菌介导
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2004年
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