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乙型肝炎病毒X基因启动子结合蛋白的研究

吴煜

  乙型肝炎病毒(HBV)基因组为部分双链环状DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科,其基因组约3200个碱基对(bp),分为结构基因和调节基因序列两部分。HBV DNA负链核苷酸序列至少有4个开放读框(ORF),4种ORF分别有各自的启动子。X基因启动子(XP)在1235-1374 nt区段,调节转录0.8的mRNA,无TATA盒,有不同的5’-端。XP的组织特异性不如CP和SP的严格,可在肝细胞以外的组织中起转录调节作用。X启动子调节编码HBxAg的0.8 kb mRNA转录,这个可调节的转录位于转录开始位点前140 nt,并且这个最小的启动子与3`-末端的增强子Ⅰ成分相重叠,由20 nt组成。这个最小的启动子象大多数HBV启动子一样与增强子Ⅰ的转录是分开的,它缺乏通常的TATA-盒或GC丰富的序列结构。但是,X启动子包含了广泛结合的位点和肝特异性转录因子,如调节作用蛋白X启动子结合蛋白(XP-BP)结合位点。HBxAg表达具有调节作用的转录包含顺式相互作用位点,能与转录因子NF1、C/EBP、ATF和AP1/Jun-Fos结合而且肿瘤抑制基因产物p53可与之结合并抑制启动子功能。我们利用人肝细胞cDNA文库,以生物素化的XP的DNA作为固相分子进行筛选,研究影响HBV DNA复制的肝细胞蛋白的结构和功能。方法应用噬菌体表面展示技术,以生物素化的HBV X基因启动子(XP)PCR产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”过程,经噬斑的PCR扩增后,构建T-A克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索,确定XP DNA结合蛋白的名称结果2001级硕士学位论文乙型肝炎病毒X基因启动子结合蛋白的研究1.噬菌体经富集后,从随机筛选的21个克隆中得到17个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBv XP DNA结合的肝细胞蛋白,共编码14种蛋白,其中9个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码尼克酞胺腺嗓吟二核昔酸脱氢酶亚型4、人血清白蛋白、泛素特异性蛋白酶10、翠丸增强基因转录子、激肤酶原。2.成功构建了HBV XP的报告基因载体。用以T ELISA法测量结果:pCAT一XP实验组CAT酶的表达是pCAT的10余倍。结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV XP的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,可能是作用于XP的反式调节因子,为进一步研究HBV的复制、转录、调节机制开辟了新的途径;成功地运用DNA为固相靶分子筛选人肝cDNA文库,确定了和HBVX基因启动子结合的肝细胞蛋白一尼克酞胺腺嚓吟二核昔酸脱氢酶亚型4(NADHPH4)等结合蛋白,噬菌体展示技术作为一种研究DNA一蛋白质相互作用的方法可进一步用于其他相关研究。……   
[关键词]:启动子;X基因;乙型肝炎病毒;基因表达谱;结合蛋白;反式调节因子;编码基因;噬菌体文库;肝细胞癌;人肝细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军医进修学院2004年