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Ⅰ紫藤脉花叶病毒的鉴定及其全序列测定 Ⅱ新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达与活性测定

梁文星

  北京地区的紫藤脉花叶病是由马铃薯Y病毒属的一种病毒侵染所致。通过机械接种的方法将此病毒的北京分离物接种到昆诺藜、苋色藜、克利夫兰烟和蚕豆上,分别产生系统褪绿斑、局部褪绿斑、轻微系统褪绿斑和系统褪绿斑等症状。ELISA分析显示此分离物与BCMV和WMV间具有血清学关系。虽然在发病紫藤种子的胚乳中能检测到其外壳蛋白的存在,但此分离物却不能通过种子传播。对提纯的病毒进行SDS-PAGE和Western blot分析,测得其CP亚基的分子量为35.0 kD。在被侵染的蚕豆叶片细胞中观察到了Potyvirus病毒所具有的典型的风轮状内含体。以上生物学特性的研究以及对其CP基因和3′-非翻译区序列的分析证明此病毒为紫藤脉花叶病毒(WVMV),这是关于此病毒在中国发生的首次报道。通过7次RT-PCR得到了WVMV北京分离物(WVMV-BJ)基因组的全序列,这是关于此病毒基因组全序列的首次报道。序列分析结果表明:WVMV-BJ全序列共9695个核苷酸,5′-和3′-非翻译区序列分别为164和252个核苷酸,中间为9279个核苷酸的开放读框,编码一个长为3063个氨基酸、分子量约为353.4 kD的多聚蛋白。此病毒基因组及其所编码的多聚蛋白的大小与其它马铃薯Y病毒属病毒较为相近。多聚蛋白含有9个可能的蛋白酶切位点,切割后产生的成熟蛋白产物中具有保守的氨基酸基序,这与其它potyviruses都非常相似。在10个蛋白产物中,CI、NIb和CP相对保守,而P1和P3变异最大。采用RT-PCR方法自WVMV-BJ的基因组中扩增出其CP基因,连接到原核表达载体pET22b(+)上。获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为34.4 kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清。微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024,酶联法测定效价为1/8192。蛋白酶抑制剂具有抑制蛋白酶活性的作用,这为通过抑制马铃薯Y病毒属编码的蛋白酶活性从而控制此类病毒提供了新的途径。用RT-PCR方法从新疆杨叶片中分离出一个Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(PTI)基因。序列分析表明;PTI基因翻译起点上游具有‘TATA’和‘CCAAT’等转录控制元件,其包含的最大阅读框架能编码一个213aa的多肽。序列比对证明PTI与克隆自欧美山杨的PtTI2和PtTI1同源性最高,分别为95%和80%。将PTI基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用。Western blotting分析表明融合蛋白与PtTI2特异的抗体之间有明显的血清学反应。……   
[关键词]:紫藤脉花叶病毒;cDNA;克隆;序列分析;杨树;蛋白酶抑制剂
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业大学2004年