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人工改造的cry1Ac、cry1Ie基因在大肠杆菌、转基因烟草和玉米中的表达

刘允军

  本研究根据植物所偏爱密码子原则,改造苏云金芽孢杆菌crylAc,crylIe野生型基因的编码区序列,人工合成crylAc,crylIe基因。将这两个基因构建到原核表达载体pET28b中,构建成原核表达载体pETAc和pETIe。将两个原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行了诱导表达。诱导表达出两个目的蛋白并进行了纯化。纯化的目的蛋白免疫兔子,制备了这两种蛋白的多克隆抗体。纯化这两种蛋白的包涵体,用玉米螟进行虫试。虫试结果显示原核表达的两种包涵体蛋白对玉米螟有较好的杀虫活性。进一步将crylAc,crylIe基因构建到真核表达载体p3301中,构建植物表达载体p3301ubiAc和p3301ubiIe。在这两个表达载体中,两个基因分别受ubiquitin启动子的调控。两个载体转化烟草并得到了转基因烟草,PCR、Southern杂交结果显示,crylAc,crylIe基因整合到转基因烟草的基因组中。用转基因烟草叶片进行虫试,结果显示转基因烟草能有效杀死玉米螟幼虫。运用PCR技术克隆了马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ的信号肽序列,并将其分别连到crylAc、gfp基因的5’端,构建植物转化载体p3301ubisigAc和p3301ubisigGFP。分别用这两个载体转化烟草,并得到转基因植株。荧光显微观察到GFP在植物细胞间隙高效表达,Western blot结果显示CrylAc蛋白也在植物细胞间隙表达。这些结果表明,马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ的信号肽序列能将外源蛋白定位到植物细胞间隙。ELISA结果显示,马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ的信号肽序列使crylAc基因在转基因烟草中的表达量显著提高。通过PCR方法,克隆了玉米叶绿素a/b结合蛋白基因的启动子(cab启动子)和玉米伸展蛋白基因的启动子(silk启动子)。将此两个启动子、玉米ubiquitin启动子与crylIe,crylAc基因分别构建成表达载体p3301cabIeubiAc,p3301silkIe和p3301ubiAc。转化玉米得到转基因玉米植株。转基因玉米田间和温室玉米螟接虫鉴定结果表明,有些转基因玉米株系具有较好的抗虫性。……   
[关键词]:cry1Ie;cry1Ac;大肠杆菌;烟草;信号肽;玉米
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2004年