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水稻黑条矮缩病毒玉米分离物的分子特性及其侵染体系

王朝辉

  水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)在日本侵染水稻引起水稻黑条矮缩病,玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus, MRDV)在欧洲侵染玉米引起玉米粗缩病,研究表明两者在寄主范围和基因组S1,S4,S5利S6存在差异。为比较RBSDV玉米粗缩病分离物全基因组水平上的变异和分子进化,以湖北玉米粗缩病病毒分离物(RBSDV-Hbm)为材料,提取病毒dsRNA,克隆并测定了基因组S1,S4,S5和S6的全序列。其中S1全长4501bp,编码约168kDa的蛋白,结构分析它含有依赖RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)特征性的GDD(Glycine-Aspartate-Aspartate)结构域和其它保守的区域。以RdRp的氨基酸序列为基础建立了相关呼肠孤病毒的进化关系。RBSDV-Hbm S4(AY160687)全长3617bp,含有一个阅读框,编码约135kDa的蛋白,同源性比较可以推测该蛋白可能是病毒的B突起(B-spike)结构蛋白:S5全长3164bp,除一个大的阅读框(ORF1)外,还可能有一个部分重叠的小阅读框(ORF2),并且ORF2起始位置与RBSDV浙江水稻分离物(RBSDV-Zjr)不同;S6全长2645bp,编码约90kDa的蛋白,其与SMC和MAD蛋白有相同的保守域。构建了RBSDV外壳蛋白P10的原核表达载体pGEX-P10,IPTG诱导后在大肠杆菌种表达。表达产物经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔制备抗血清,分别建立了ELISA和Western blotting检测方法,成功地从病叶和灰飞虱体内检测到病毒,其中ELISA可以从健叶稀释液中检测到160ng的P10,病叶稀释到1/1280也可以与健康材料区分开。用粗提纯的RBSDV病毒侵染水稻原生质体和小麦质壁分离的悬浮细胞。两天后用主要外壳蛋白P10和病毒非结构蛋白P6抗血清Western blotting检测,结果都呈阳性。用P10抗血清也证明了病毒粗提液能够直接侵染小麦悬浮细胞和愈伤。为验证提取的病毒基因组的侵染活性,分别设三种处理,即:ssRNA、dsRNA和ssRNA/dsRNA mix,脂质体包被后电击转染水稻原生质体,P8抗血清Western blotting检测结果呈阳性,表明病毒RNA在细胞内翻译产生了相应的蛋白。Northern blotting检测dsRNA和ssRNA/dsRNA mix转染的细胞结果呈阳性,ssRNA处理的结果呈阴性,证明病毒基因组dsRNA非常稳定,在细胞中不容易降解。该研究为建立反向遗传学体系打下了基础。……   
[关键词]:RBSDV;玉米粗缩病;序列分析;P10;检测;侵染
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2004年