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玉米鼠耳病病原鉴定及检测系统建立

李雪燕

  玉米鼠耳病(Maize wallaby ear virus MWEV)是我国近年来发生的一种重要玉米病害,具有毁灭性、流行性、爆发性等特点。二点叶蝉Cicadulina bipunctella(Mats)是玉米鼠耳病的主要介体昆虫之一,在该病的发生、扩展蔓延中起着关键作用。因此,我们着眼于西南地区玉米鼠耳病发生状况,在确定玉米鼠耳病优势介体种群的基础上,探讨二点叶蝉与玉米鼠耳病的关系,建立实验种群,研究环境因素尤其是温度对二点叶蝉种群的影响。同时对玉米鼠耳病病原进行鉴定,以期确定玉米鼠耳病病原;用提纯的病原制备抗血清,建立玉米鼠耳病检测系统。研究结果如下:1.二点叶蝉和玉米鼠耳病关系的确立在玉米鼠耳病病区采集为害玉米的主要昆虫,对采集的昆虫的进行传毒测定,结果表明仅二点叶蝉能够致使玉米表现出鼠耳病的典型症状,且二点叶蝉是玉米鼠耳病病区为害玉米的优势叶蝉种群(平均密度为0.0629~3.0114头/株)。玉米被二点叶蝉取食后,其发病率高达96%。该病表现为系统性矮化,叶片皱缩粗糙,僵直挺立,症状类似玉米粗缩病。其余的飞虱、叶蝉、蚜虫及蝽类取食玉米后不能导致玉米出现典型的玉米鼠耳病症状。证明二点叶蝉是玉米鼠耳病的介体昆虫之一。2.玉米鼠耳病传毒方式及毒源的繁殖玉米鼠耳病不能通过摩擦接种、菟丝子桥接、注射接种的方式传播,玉米鼠耳病毒源的建立与繁殖只能依靠二点叶蝉传毒完成。玉米最适于二点叶蝉种群增长,且玉米植株上症状明显,种植方便,生长迅速,是毒源繁殖的最佳寄主。将带毒的二点叶蝉转到N.tabacum somsun(n/n),N. samsun(N/N), N. tabacum xamthi(nc),K326,白肋烟,心叶烟,普通烟,本氏烟,珊西烟,苋色黎,昆黎,灰黎,黄苗榆,矮牵牛,番茄,假酸浆上后,二点叶蝉不能在这些双子叶植物上存活,且上述植物无症状出现,因此不能作为玉米鼠耳病病毒的鉴别寄主。以玉米为寄主,在实验室成功地建立了二点叶蝉实验种群并繁殖了大量的玉米鼠耳病病株毒源,在25~28℃条件下,二点叶蝉在实验室大约30天一代,己连续饲养了20代。每个养虫箱内二点叶蝉成虫大约在3000头左右,共收集到约5kg的玉米鼠耳病病株。3.无毒种群的建立分别采用从田间采集、从卵分离、蜕皮分离、混合种群分离的方法建立二点叶蝉无毒种群。结果表明,二点叶蝉自然混合种群利实验种群中不存在无毒种群。在田间,二点叶蝉是鼠耳病存在、发病和蔓延的前提,玉米鼠耳病为二点叶蝉的存在提供基本信息。二点叶蝉取食24h时,虽部分个体不能致玉米发生鼠耳病。但是对其子代进行致病测试实验表明,该种西南农业人学硕[学位论文中文摘要群仍然可以致玉米表现出鼠耳病病症,且发病率高达94.5%,与原始种群发病率相似。4.温度对二点叶蝉的发育、存活及繁殖的影响系统研究了不同温度(巧,20,25,28,犯,35℃)条件下二点叶蝉实验种群在玉米幼苗上的发育、存活情况,并用生命表资料分析了温度对其种群增长的影响,拟合二点叶蝉发育速率与温度之间的关系模型,求出各发育阶段的发育起点温度和发育上限、下限温度,组建不同温度下实验种群特定时间生命表,计算种群增长参数,分析种群增长参数与温度之间的关系。结果表明,在巧℃下,卵不能完成发育,在35℃条件下三龄若虫不能存活。二点叶蝉种群增长最适温区为25一32℃。在该温区范围内,内票生殖力为0.0631一0.0463,周限增长率为】.0561一1 .0497,种群存活曲线属于Deeveyl型,而在15℃不利条件下,种群存活曲线属于Deevey川型5.玉米鼠耳病病原鉴定对二点叶蝉唾液腺,马氏管,肠道以及玉米病叶,病根,耳突组织超薄切片透射电镜观察,在二点叶蝉的肠道切片上观察到疑是玉米鼠耳病的病毒粒子,玉米病叶、病根、耳突组织上未能观察到病毒粒子。优化病毒提纯程序,基本提纯了玉米鼠耳病病毒,其分光光度计检测紫外吸收值A26办280=2 .1。根据提纯的病毒液260nm处的吸光值,计算出提纯病毒的浓度为1.6m留m!,产量为0.05u留g病株材料。用四环素等抗生素类药剂处理病株,结合玉米病株、二点叶蝉各组织的超薄切片,电镜观察结果排除了植原体的可能性。根据病害的病症、传播介体,以及病原的初步鉴定结果把发生在四川南充,重庆壁山的玉米病害诊断为玉米鼠耳病,玉米鼠耳病病原疑为玉米鼠耳病毒(MWEV)。6.玉米鼠耳病检测系统的建立用玉米鼠耳病病株分离提纯了玉米鼠耳病病毒,制备了特异性的抗血清。利用价格低廉的羊抗兔酶标抗体,建立了快速灵敏的OAS一ELISA检测方法。通过DAS一ELISA方阵实验,确定抗血清及羊抗兔酶标抗体的稀释度分别是l:1000和1:5000,以此作为DAs一ELISA检测的最适合条件。DAS一ELISA检测病叶粗提纯液的最大稀释度可以达到1:640。在实际中我们选用1:20作为病叶粗提纯液的稀释度,此时阳性反应0D值较高,阴阳反应差异较大。将建立的DAS一ELISA检测方法用来检测带毒的_一点叶蝉时,其检测结果不理想(0D值仅为0 .574)。……   
[关键词]:玉米鼠耳病;二点叶蝉;病原鉴定;检测系统
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2004年