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工程菌生物转化D-型氨基酸的研究

钮利喜

  光学活性的D-氨基酸作为一种中间体被广泛应用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂等的合成。非天然D-氨基酸常用生物法或生物-化学法生产。底物5’单替代海因首先由D-海因酶转化为中间物N-氨甲酰-D-氨基酸,然后被N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(DCase)或者化学脱酰胺将其进一步转化为D-氨基酸。目前,工业范围的D-氨基酸生产都采用酶法转化。按本室从菌株SS-ori中纯化的DCase的N-末端氨基酸序列设计了正向引物,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上设计了简并反向引物。用菌株SS-ori总DNA为模板,经PCR扩增得到一长度约为0.9kb的片段,DNA测序表明基因全长912bp。将DCase基因分别克窿到pUC18、pET3a、pET32M、pRSET、pGEX4T-2、pExSecI、pMAL-c2X等一系列表达载体中,然后在E.coli DH5α、E.coli 2426、E.coli BL21中进行表达。但大多数表达产物为包涵体而不具酶活性。最终在工程菌E.coli BL21/pMD中获得DCase可溶表达,表达产物为融合蛋白MBP-DCase(77kD),SDS-PAGE光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的20%。经Amylose亲和纯化和Superose 12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X质粒背景,用Factor Xa剪切后,可得约42kD的MBP和35kD的DCase。酶活性检测表明,当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸作为底物,细胞浓度达OD600nm=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸约1.0克。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了工程菌E.coli EHD-YZⅡ6和天然菌SS-ori转化DL-对羟基苯海因的反应产物,探讨了流动相组份及其比例对分离的影响,结果表明流动相为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.2)和甲醇的混合溶液(体积配比为90:10),为最佳洗脱缓冲系统;采用C_(18)拄,在波长254nm检测条件下,有较好分离效果。底物DL-对羟基苯海因(DL-HPH)以及产物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(CpHPG)和产物D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数在0.99以上。用HPLC法既可测定D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的活性,又可对转化产物CpHPG和D-HPG进行了定量分析。由于N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶极易氧化失活且耐热性较差。因此采用易错聚合酶链式反应(error prone PCR)的方法,对DCase进行定向进化,已获得初步结果,并构建了pET32M-CAT质粒,旨在利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)的高度可溶性对突变文库进行初步的可溶性表达筛选。进一步工作正在进行中。……   
[关键词]:D-氨基酸;N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶;可溶性融合表达;生物转化;指定性进化;高效液相色谱
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山西大学2004年