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冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究

霍秀文

  冰草属(Agropyron Gaertn.)植物是寿命较长的多年生疏丛型禾本科牧草,广泛分布于干旱、半干旱草原和荒漠草原,抗逆性较强,春季返青早,秋季枯黄晚,茎叶柔嫩,营养丰富,适口性好,在我国北方地区有广泛的种植面积,是干旱半干旱地区改良草场以及建立人工草地和生态建设的重要草种。本研究以冰草属植物中的4个品种——蒙古冰草新品系(A.mongolicum Keng)、航道冰草(A.cristatum cv. ‘Fairway’)、诺丹冰草(A.desertorum cv.‘Nordan’)和一个种间杂种冰草——蒙农杂种冰草(A.cristatumхA.desertorum cv.‘Hycrest-Mengnong’)为材料,分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系。在此基础上,以调控脯氨酸生物合成最后一步的关键酶的突变体基因P5CS为目标基因,bar基因为筛选标记基因,用基因枪法轰击幼穗诱导的愈伤组织,获得转基因植株,为冰草的遗传改良提供新种质。植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。CBF4转录激活因子是一类受干旱特异诱导的反式作用因子。它能与CRT/DREDNA调控元件特异结合,促进启动子中含有这一调控元件的脱水诱导基因的表达,从而激活植物体内的多种耐逆机制。但是有关CBF4启动子的特异性研究,尚未见相关报道。为研究CBF4基因及其启动子在转基因冰草中的表达特性,探索其在冰草抗逆基因工程研究中的应用价值,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中分离得到了CBF4及其启动子,并对CBF4启动子进行了序列分析和初步的功能分析。研究初步获得以下结果:1.以冰草幼穗为外植体诱导愈伤组织的最适培养基为改良MS+2,4-D 2.0mg/L,诱导率83.5%;2.2002年分化培养基为MS(无附加成分),分化率59.6%。2003年优化分化培养基为MS+KT0.2mg/L,分化率74.5%;3.生根培养基为1/2MS,生根率100%;4.适宜的取样时期为孕穗期,长度介于1.0~3.0cm的幼穗为最适宜的外植体;5.4种冰草材料均可以幼穗为外植体诱导愈伤组织并分化形成完整植株;6.以幼穗诱导的愈伤组织为受体,采用基因枪轰击法转化冰草获得转基因植株;7.PCR和Southern检测表明外源基因P5CS已整合到冰草属植物基因组DNA中;8.RT-PCR检测表明目的基因已在冰草转基因植株的转录水平表达;9.2002年和2003年P5CS基因的遗传转化率分别为0.09%和0.11%;10.采用PCR方法从拟南芥中分离了CBF4基因及其启动子序列。 11.采用生物信息学方法对启动子进行序列分析,表明CBF4启动子可能为逆境诱导型启动子。将其与GUS基因融合转化烟草,GUS活性检测初步表明该启动子受干旱逆境诱导。……   
[关键词]:冰草;植株再生;遗传转化;P5CS基因;CBF4;CBF4启动子
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:内蒙古农业大学2004年