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番茄花叶病毒(ToMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)单克隆抗体制备及ToMV在烟草上致病分子机理研究

于翠

  番茄花叶病毒(ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员。由于ToMV与烟草花叶病毒(TMV)具有很近的血清学关系,基于多抗血清的检测方法较难区分二者。利用ToMV提纯病毒作为免疫原,通过杂交瘤技术获得4株ToMV的单克隆抗体,其中2株为ToMV特异性单抗,2株能同时检测ToMV和TMV。4株单抗腹水ELISA效价在1:32000-1:1024000之间。Western印迹分析表明,只有2株单抗与ToMV 17.6 kDa的外壳蛋白亚基有特异反应,而另2株无反应,推测它们是针对构象决定簇的抗体。建立了三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)检测ToMV和TMV的方法,结果表明4株单克隆抗体检测病汁液的稀释度均能达到1:2000倍以上。以制备的单抗和建立的TAS-ELISA方法对杭州市郊和云南部分地区的烟草、辣椒、番茄等田间发病样品进行检测,结果发现田间样品以TMV侵染为主。ToMV和TMV亲缘关系很近,但二者在含N基因烟草上所产生的枯斑大小有显著差异。为确定TMV和ToMV在含有N基因烟草上症状差异的决定因子,比较了TMV、ToMV及用ToMV运动蛋白(MP)基因精确置换TMV MP基因后获得的重组病毒T/OMP在不同寄主上的症状差异,发现T/OMP在含N基因烟草上产生的枯斑大小与ToMV相似。系统分析比较了TMV、ToMV和T/OMP外壳蛋白(CP)和MP在植物体内的积累水平,发现3种病毒的CP和MP在测定的时间内没有明显的差异。Northern印迹分析表明TMV和T/OMP在原生质体中的复制水平也没有差异。同时,测定了TMV、ToMV和T/OMP接种后烟草体内防御相关酶(PAL、POD和PPO)的活性变化,T/OMP和TMV所诱导酶活性水平变化趋势基本一致,而与ToMV有所差异。以上结果表明ToMV和TMV在含N基因烟草上的症状差异可能是由MP基因的功能差异决定的。黄瓜花叶病毒(CMV)是世界范围内广泛分布的最具经济重要性的植物病毒之一。CMV具有许多株系或分离物,根据不同的鉴定方法和分类系统,不同的分离物主要被划分为两个亚组。以CMV亚组Ⅰ分离物CMV-RB和CMV亚组Ⅱ分离物CMV-Z分别免疫BAL B/C小鼠,通过杂交瘤技术共获得9株稳定分泌单克隆抗体的细胞株。间接ELISA方法测定表明9株单抗的腹水效价在1:32000-512000之间。以TAS-ELISA方法检测单抗的特异性,结果发现6株单抗能特异地与CMV亚组Ⅰ或亚组n分离物发生反应;2株单抗既能与亚组I也能与亚组H的分离物反应,1株单抗只能与提纯病毒反应,而不能与粗汁液中的病毒反应。利用其中的8株CMV单抗建立了快速区分CMV不同亚组分离物的TAS一ELISA检测体系。与间接ELISA方法相比,TAS一ELISA在检测亚组I分离物时二者没有显著的差异,但对于亚组n分离物,TAS一ELISA的检测效果要优于间接ELISA。利用TAS一ELISA方法测定了来自不同地区的197份田间样品,结果发现130份样品为CMV,其中亚组I分离物为121份,占93 .1%,而亚组11分离物为9份,占6.9%。还建立了区分CMV不同亚组分离物的免疫捕获反转录PCR(IC~Rl’- PCR)检测体系,并对TAS一ELISA反应中为阳性反应的CMV分离物进行了检测,结果表明TAs一ELIsA检测为cMV亚组I的样品仅能用亚组I特异性引物扩增出约500bP的条带,而TAS一ELISA检测为亚组n的样品也只能用亚组n特异性引物扩增出约600bp的条带。对其中的10个CMV分离物的IC一RT一PCR产物进行克隆和序列测定,序列分析表明TAS一ELISA、IC一RT一PCR和序列测定对CMV亚组的划分是一致的。TAS一ELISA和IC~R下PCR快速区分CMV亚组I和亚组H体系的建立,为研究CMV的变异进化提供了简便的方法,对了解黄瓜花叶病毒不同亚组分离物在我国的发生分布与流行情况具有重要意义。……   
[关键词]:番茄花叶病毒;烟草花叶病毒;黄瓜花叶病毒;单克隆抗体;运动蛋白亚组;TAS-ELISA;IC-RT-PCR
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2004年