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α-淀粉酶原因的体外定向进化研究

张建云

  α–淀粉酶是最重要的一类工业酶类之一,它在淀粉加工、酿酒、乙醇生产、纺织和其它工业部门上都有广泛的应用,并且也是酶学研究中最活跃的领域。本研究采用5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP),对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变。本试验采用基因体外定向进化策略中PCR基因诱变技术,使用碱基类似物5-溴脱氧尿苷三磷酸为诱变剂,利用热稳定性的Taq聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变,突变库的筛选用锥虫蓝淀粉(LBSP)鉴别培养基。经过多轮诱变,得到五个具有高酶活的诱变基因,并在Genebank上注册,序列号为AY645667,AY645668,AY645669,AY645670,AY645671。利用生物学软件DNAman和出发基因序列进行比较,分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果表明突变多发生在第300-360个氨基酸之间(即在保守区4区以及其下游区域)。这说明酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变而引起的,而不是由启动子的变化引起的。进一步的分析还发现:5-BrdUTP不仅能够代替T掺入DNA产生A.T—G.C的转换,代替C掺入DNA产生G.C—A.T的转换,而且也能够产生颠换。碱基类似物掺入诱变简便,快捷,成为基因体外定向进化的又一新策略。本试验的工作进一步验证了这一方法的可行性,并为研究α-淀粉酶基因突变位点和酶功能的关系提供了材料,从而为进一步研究α-淀粉酶基因进化过程打下了基础。……   
[关键词]:定向进化;碱基类似物;诱变;α-淀粉酶基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河南农业大学2004年