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大鼠TGFβⅡ型受体胞外区与IFNγ融合表达及其抗肝纤维化研究

郁子扬

  肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程,其主要的病理特征为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝Disse间隙的过度沉积。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化发生时主要的ECM合成细胞,其活化过程主要由转化生长因子(TGF)β介导,后者是最强的促HSC活化因子。因而TGFβ/HSC轴作为潜在的抗肝纤维化治疗靶点,受到众多研究者重视。TGFβ发挥生物学作用须与细胞表面TGFβ受体(TβR)结合。而缺陷型TGFβⅡ型受体(dominant-negative TβR)、可溶性TβRⅡ(soluble TGFβRⅡ,sTβRⅡ)共同点是均可结合TGFβ而不能启动信号转导。另有研究表明,IFNγ在体外及体内实验中均抑制HSC活化,减轻动物肝纤维化程度其机制为通过JAK/STAT途径抑制TGFβ信号转导,从而拮抗后者的致纤维化作用,因而sTβRⅡ和IFNγ在抗肝纤维化中具有潜在的协同作用。细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物,其生物学活性较各单体大大增强。为探讨sTβRⅡ和IFNγ在抗肝纤维化中潜在的协同作用及融合表达对细胞因子活性的增强作用,本研究在国内外首次构建了稳定表达大鼠sTβRⅡ-IFNγ(sTβRⅡ-IFNγ)融合蛋白的真核表达系统。通过体外抗HSC活化实验和体内抗肝纤维化基因治疗实验证明sTβRⅡ和IFNγ融合表达可使两者发挥联合作用,为新型抗肝纤维化药物研究奠定了基础。Part 1.大鼠sT胆n一IFN丫融合蛋白真核表达及体外杭HsC活化研究从大鼠肝脏提取mRNA,分别采用相应引物RT-PCR扩增得到sTp斑I和IFN丫基因片段,先将IFN丫基因定向克隆至pseeTagZ表达载体,经amp抗性筛选、酶切鉴定、测序鉴定后,转染CHo细胞检测目的蛋白IFN丫的正确表达。再将sTpRll基因以常规方法定向克隆至psecT’ag2/I FN丫重组体,经田,p抗性筛选、双酶切及测序鉴定后,得到 psecl’a gZ/sTp犯卜IFN丫真核表达质粒,并以脂质体包裹转染cHO细胞,经zeodn抗性筛选得到高效稳定表达sTp班I一正脚的细胞株。分别采用W比tem B10tting和ELISA方法检测转染后CHO培养上清,.证实其中含有可同时与sTpRll抗体和IFN丫抗体发生特异性反应的目的蛋白,分子量约为43kDa。为检验该融合蛋白sTp班I部分和IFNY部分的生物学活性,分别采用抗TGFp增殖抑制实验和抗病毒活性实验。在实验中,TGFp对MvlLu增殖抑制作用可被sTpRH一IFNY融合蛋白拮抗,且具有浓度依赖关系,证明sTpRll一IFN丫融合蛋白具有sTpRH的生物学活性:在抗病毒活性实验中,无sTpRI 1.开N丫保护的L929细胞在一定浓度的vSV攻击下在24小时内即出现典型的病毒感染迹象,而经sTpRH·IFNY融合蛋白预先处理的L929细胞抵御VSv攻击的能力大为增强,且sTpR工卜IFN下保护力与其浓度有依赖关系。说明sTp犯I一IFN丫具有大鼠IFNY抗病毒活性。在进一步的体外抗肝纤维化实验中,用sTpRll一I刚丫预处理HsC,然后以TGFpl诱导其活化,72小时后以Wrestem Blotting法检测其a一SMA和Coll、111表达。结果表明,sTpRH·IFNY预处理的Hsc对TGF印的反应性发生显著改变:表现为a一sMA和coll、m表达较单独TGF印处理组HsC显著减少,表明该融合蛋白在体外实验中可抑制Hsc活化及EcM表达,且该作用较单体sTpRH或IFN丫更强,因此sTpRH一IFN丫融合蛋白可能具有潜在的肝纤维化协同作用。结论:1.本研究成功构建了表达大鼠sTp即I一IFN丫融合蛋白的真核表达质粒psecTagZ/sTpRll一IFNY,并在真核细胞中表达出同时具有sTpRn和IFN丫生物学活性的重组融合蛋白sTpRll一IFNY;2.该融合蛋白在体外实验中具有显著抑制HSC活化的作用,可减少其价SMA和eolx、lxx表达,且作用较单独sTpRll或IFN丫更强。因此具有sTpRll和IFNY抗肝纤维化的联合作用。Part n.psecTagZ/sTpRll一IFNY真核表达质粗基因治疗杭大民肝纤维化的初步研究为进一步研究psecTagZ/s TGFp犯I一IFNY表达质粒体内抗肝纤维化作用,采用裸质粒直接肌肉注射的方法将其导入DMN诱导的大鼠肝纤维化模型体内,观察sTGF日班I一IFN丫融合基因在体内抗肝纤维化试验中可能具有的协同作用。首先用DMN诱导建立了大鼠持续性肝纤维化模型,该方法操作较胆管结扎(BDL)简便,而诱导的肝纤维化的持续时间较长,其特点为胶原成分增加迅速。预试验中,大鼠被腹腔注射DMN10林留g体重、每周3次、连续6周,停止给药行肝脏组织病理学检查,见大鼠肝脏呈现明显纤维化改变;且停止DMN给药5周后,再行组织病理学检查肝纤维化程度未见明显减轻,表明DMN诱导的肝纤维化持续时间较长,自愈现象不明显,纤维化模型合格。正式实验中我们沿用了同样的方法诱导大鼠肝纤维化。在动物模型建立以后,将其随机分组后分别给予pseCTagZ/s Tp斑卜IFN丫、psecTagZ八FN丫和pseeTagZ/sTpRll、pseeTagZ空质粒作基因治疗,并以未处理的肝纤维化组和正常组大鼠为对照,以期通过在体内高效表达相……   
[关键词]:抗肝纤维化;IFNγ;TGFβ;大鼠;Ⅱ型受体;融合蛋白;纤维化程度;细胞因子;stellate;肝星状细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2004年