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猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究

王祥

  乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE),是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus,JEV)引起的人和动物共患的一种虫媒病毒性疾病。本病对人类危害巨大,是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一;对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失。猪是本病毒的扩增宿主,带毒猪是本病的主要传染源。因此,防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失,而且也是防止人患乙脑的重要措施。本研究着眼于猪乙脑快速诊断方法和疫苗的开发利用,主要工作包括:1.减毒活疫苗的研究选用原代金黄地鼠肾(PHK)细胞作为培养基质,JEV SA14-14-2毒株为生产用疫苗毒株进行疫苗研制。测定表明SA14-14-2毒株能在PHK细胞上进行稳定增殖,且有较高的滴度(≥10~(-7.2TCID_(50)/1.0mL)。采用蔗糖明胶作为冻干保护剂,冻干后毒价≥10~(-6.8)TCID_(50)/1.0mL。疫苗原液接种血清学阴性小白鼠和妊娠母猪,小鼠无死亡和异常反应,怀孕母猪无流产和产死胎、木乃伊胎,均正常分娩,胎儿发育正常,说明疫苗是安全的。免疫原性测定说明,该疫苗能引起小鼠产生特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答;40日龄仔猪免疫后可产生JEV特异性抗体。疫苗在4-8℃和.20℃可保存一年半。综上,该疫苗安全,免疫原性好,且便于大规模生产。2.滴金免疫法(DIGFA)的建立与应用将浓缩的JEV抗原吸附到硝酸纤维素膜上,加入JEV阳性、阴性血清和红色胶体金颗粒标记的兔抗猪IgG探针,摸索最佳工作条件,结果表明硝酸纤维素膜上最佳抗原吸附浓度为0.147mg/mL,最佳探针浓度为1∶20,最佳封闭浓度为5%BSA。用该法与HI试验对比检测54份送检猪血清,两法总符合率为81.4%,阳性符合率为71.4%,阴性符合率为65%,其敏感性比HI高,整个过程可在数分钟内完成。因此,DIGFA具有快速、简便、敏感、特异的特点,可用于实验室和现场JEV抗体的检测。3.prM、E和NS1基因片段的克隆表达与基因免疫从自行研制的乙脑减毒活疫苗中提取JEV基因组RNA,合成3对引物,以一步法RT-PCR技术扩增获得了3个主要免疫原性基因片段的编码序列,大小分别为prM(558bp)、E(615bp)、NS1(1146bp),其中prM和NS1为全基因,E为前1/3(N端)片段。以pMD18-T为克隆载体,得到3个克隆质粒pTprM、pTE、pTNS1。构建3个基因的原核表达载体,实现了NS1基因在BL21(DE3)菌株中的高效表达,Western-blot检测表达的NS1蛋白具有生物活性。以质粒peDNA3 .1为载体,构建3个基因的核酸疫苗质粒,均实现了在真核细胞BHK一21中的表达,且表达产物具有生物活性。核酸疫苗质粒免疫的小鼠产生了特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应。从效果上看,三基因联合免疫最好,单基因以NSI为好。4. TK-/gG很51十重组病毒的构建设计1对引物从p翎S1上亚克隆Nsl基因,将NSI基因插入到中间转移载体pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK~NSI。将pUSK一S1与伪狂犬病毒Ea株TK一G,/ Lacz+突变株共转染真核细胞IBRS一2,通过空斑纯化得到了乙脑病毒NSI基因重组伪狂犬病毒TK一G水51+。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NSI蛋白。该重组病毒可作为猪乙脑和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。……   
[关键词]:乙型脑炎病毒;减毒活疫苗;滴金免疫法;克隆表达;基因疫苗;重组病毒
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2001年