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重组hCGβ乳酸杆菌的构建及其对小鼠阴道粘膜免疫的效果

王红梅

  临床试验表明,hCGβ为基础的避孕疫苗安全、有效且避孕效果可逆;但总有效率仅为80%-85%。不能在生殖道局部产生足够的抗原特异性抗体,可能是避孕效果不完全的主要原因。通过粘膜免疫可在全身粘膜,包括生殖道局部产生高滴度的抗体,从而使其抗生育作用更加直接、有效。乳酸杆菌作为人体的正常菌群,可在粘膜局部持续表达抗原而诱发特异性免疫应答。因此,为了探索以乳酸杆菌作为载体表达抗原,经粘膜免疫应用于避孕疫苗的可行性,本研究应用乳酸杆菌稳定表达hCGβ,并经阴道粘膜免疫小鼠,分析工程菌在阴道局部产生抗原的能力及阴道局部hCGβIgA抗体水平,并研究其相关机制。第一部分:重组hCGβ乳酸杆菌的构建及其体外分泌性表达目的:构建乳酸杆菌表达质粒pIlac-hCGβ,转化乳酸杆菌,使其稳定地分泌表达hCGβ蛋白抗原。方法:首先从短小乳酸杆菌基因组,PCR扩增得到670bp的S-层蛋白表达信号序列,将其信号肽序列与hCGβ基因连接后克隆入乳酸杆菌整合型表达载体pllac的lac启动子下游,得到质粒pllac-hCGβ;将pllac-hCGβ电穿孔转化干酪氏乳酸杆菌Lactobacillus casei CECT5276,得到重组菌Lb casei hCGβ。PCR及测序分析外源基因在乳酸杆菌基因组中的整合情况,放免法分别检测培养上清及细胞裂解液中的hCGβ,Western blotting鉴定培养上清中的hCGβ蛋白。将重组菌在无选择压力条件下培养50代后,接种培养,继续检测上清中目的蛋白的表达,并通过调整培养液的pH值、表达诱导剂乳糖浓度和表达抑制剂葡萄糖浓度,摸索表达效率最佳的培养条件。结果:对重组乳酸杆菌基因组PCR产物测序,证实hCGβ基因已经成功整合到Lb. casei的基因组中;重组菌产生的目的蛋白有78.5%分泌进入培养上清;而加入诱导剂乳糖后21小时,上清中的hCGβ浓度达到峰值,为440mIU/ml,其后逐渐下降。将重组菌在无选择压力条件下培养50代并冻存后仍可持续分泌hCGβ。调节培养液的pH值和乳糖浓度对重组菌分泌hCGβ的能力有影响,以pH值为7、诱导剂乳糖浓度为0.75%时目的蛋白表达效率最高。Western blot分析重组菌诱导培养上清,显示22kDa的蛋白条带,证实重组乳酸杆菌确实可分泌hCGβ蛋白抗原。结论: hCGβ在Lb. casei CECT5276中得到了稳定、分泌性表达。关键词:hCGβ,乳酸杆菌,分泌,表达第二部分 表达hCGβ的乳酸杆菌对小鼠阴道免疫及其免疫效果目的:用稳定、分泌性表达hCGβ的乳酸杆菌菌株经阴道免疫小鼠,检测重组菌在小鼠阴道局部的抗原分泌水平及阴道局部特异性IgA抗体水平,并分析抗体产生机制,以探讨乳酸杆菌表达外源蛋白抗原经粘膜免疫应用于免疫避孕的可行性。方法:将pCMV4-hCGβ质粒磷酸钙共沉淀法转染COS-7细胞,Western blotting鉴定COS-7细胞所表达的hCGβ蛋白。大量制备pCMV4-hCGβ质粒,胫前肌注射免疫8周龄BALB/c雌性小鼠,4周后加强免疫一次。免疫后2周取血清检测抗hCGβIgG抗体水平。为了解重组乳酸杆菌是否可在小鼠阴道局部定居并分泌表达hCGβ抗原,将109稳定、分泌性表达hCGβ的乳酸杆菌Lb caseihCGβ 接种于8周龄BALB/c雌性小鼠阴道,分别于第3、7、14天获取阴道洗液,放免法检测hCGβ,以确定重组菌是否可在阴道粘膜局部分泌表达hCGβ。然后,分别将107、108、109Lb caseihCGβ重组菌经阴道粘膜免疫8周龄BALB/c雌性小鼠,3周后加强免疫一次。于加强免疫后2周取阴道洗液, ELISA法检测抗hCGβIgA抗体水平,3H-TdR掺入法检测hCGβ特异性脾淋巴细胞增殖反应,ELISA检测经抗原刺激后脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子Il-4的水平。为了比较DNA免疫与粘膜免疫的效果,将108Lb caseihCGβ重组菌经阴道粘膜免疫BALB/c小鼠,9pmol pCMV4-hCGβ质粒肌肉注射免疫另一组BALB/c小鼠,3周后分别取血清和阴道洗液,ELISA检测血清和阴道局部产生的抗hCGβIgA抗体水平。结果:(1)Western blotting显示COS-7细胞分泌至培养基中的蛋白分子量约为22KDa,与目的蛋白一致。经pCMV4-hCGβ肌肉免疫后,小鼠血清中可检测到抗hCGβIgG抗体。(2)Lb caseihCGβ菌接种于小鼠阴道后第3、7天,2/2只小鼠阴道洗液中可检测到hCGβ,第14天的阴道洗液中,1/2只可检测到hCGβ,而用未整合hCGβ的乳酸杆菌经阴道粘膜免疫的阴性对照小鼠阴道洗液中未检出hCGβ,说明该重组菌可在阴道粘膜定居,并分泌hCGβ蛋白。(3)用107、108、109重组菌经阴道粘膜免疫小鼠,加强免疫后2周,阴道洗液中检测到了抗hCGβIgA抗体,hCGβ特异性脾细胞增殖试验证实脾细胞中含有已被致敏的淋巴细胞;hCGβ刺激后脾细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子Il-4均显著增加,说明乳酸杆菌表达的hCGβ确实能够通过共同粘膜免疫机制在生殖道局部刺激产生特异性的IgA抗体。(4)将108Lb caseihCGβ重组菌经阴道粘膜免疫8周龄BALB/c小鼠,9pmol pCMV4-hCGβ质粒肌肉注射免疫8周龄BALB/c小鼠,两种免疫方式在阴道局部产生的抗hCGβIgA抗体水平无显著性差异,而两组血清中均未检测到抗hCGβIgA抗体。结论: 表达hCGβ的乳酸杆菌可在阴道粘膜局部定居;并能通过粘……   
[关键词]:hCGβ;乳酸杆菌;阴道粘膜免疫;抗hCGβ IgA抗体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:复旦大学2003年