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脑出血后脑组织线粒体结构功能及ATPase-6基因表达变化的研究

李玮

  背景与目的:脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种常见的神经系统疾病,发病率高。在欧美国家占整个脑血管病的10%~15%,中国和日本甚至高达40%。由于其较高的致残率和死亡率,严重威胁着人类健康与生命。如何降低ICH的致残率、死亡率,一直是医学界十分关注的问题。脑组织对能量代谢有独特的要求,神经细胞对能量供应的改变异常敏感。由于神经元再生能力差,脑的能量代谢异常必然影响到神经系统功能和结构的完整性。对脑出血后神经细胞损伤机制进行深入研究将有助于治疗方法的改进,降低神经功能缺损程度。线粒体是细胞氧化代谢的工厂,是细胞内三磷酸腺酐(adenosine triphosphate ,ATP)合成的中心。目前,对脑出血后脑组织线粒体功能、结构变化的规律还缺乏深入的了解。本实验将重点对脑出血后血肿周围组织线粒体的结构、功能及直接影响ATP合成的ATPase-6基因表达进行研究,以期为脑出血的临床治疗提供新的理论依据。方法:实验分四部分:1、模型建立:采用50μl鼠尾血注入尾状核建立大鼠脑出血模型,分别于造模后12h、24h、3d、1w取血肿周围脑组织进行检测,处死前进行大鼠神经功能缺损评分。对照组进针位置相同,但不注血。2、线粒体功能测定:(1)制备脑线粒体:30s内迅速取脑,置入预冷的分离介质中洗涤,选取血肿周围3mm范围内脑组织,玻璃匀浆器手工匀浆(8上8下)后在0-4。C条件下Ficoll介质密度梯度离心法提取脑线粒体;(2)Lowery 法测定提取线粒体蛋白含量;(3)将每个线粒体提取液样本浓度调整至3mg/ml,Clark氧电极法测定线粒体呼吸控制率;(4)利用荧光偏振技术测线粒体膜流动性;(5)比色法测定线粒体琥珀酸脱氢酶比活性。3、观察线粒体超微结构变化:取24h、1w出血组的大鼠血肿周围脑组织固定包埋,超薄切片,透射电镜观察。4、线粒体ATPase-6基因表达测定:用 RT-PCR方法。结果:1.脑出血术后大鼠均出现不同程度的神经功能缺损;2.(1)脑出血后12h血肿周围组织线粒体膜平均微黏度与对照组比较无明显差异。出血1d平均微黏度(η)较对照组增大,即膜流动性减小 (P<0.05)。出血3d及7d线粒体膜平均微黏度(η)进一步增大,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。(2)血肿周围组织线粒体呼吸控制率(RCR):脑出血1天后血肿周围组织线粒体呼吸控制率开始下降(P<0.05),至第7d时较对照组明显降低(P<0.01)。(3) 大鼠脑线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)活性出现明显下降的时间相对较晚,3d后方明显下降,(p<0.05)。7d后则下降更为严重,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。3.线粒体超微结构变化:出血早期(24h)时线粒体结构的病理变化主要表现为基质疏松, 部分线粒体膜变为单层界膜, 大部分线粒体仅出现嵴排列紊乱,但大小、结构基本正常。出血晚期(1w): 较之出血24h时线粒体的病变更为明显, 可见线粒体肿胀,嵴减少或断裂,线粒体破坏较为严重。4.线粒体ATPase-6基因表达:出血12h 后ATPase-6基因表达下降, 24h时有所回升、第3d时其表达量再次下降,但此三个时点与对照组比较P>0.05,而在出血后第7天时下降明显(P<0.01 )。结论:1.脑出血早期血肿周围组织线粒体功能早期下降不明显,晚期方明显受损。2.脑出血早期血肿周围组织线粒体超微结构损伤较轻微,晚期受损较严重。3. 脑出血早期血肿周围组织线粒体中参与ATP合成的ATPase-6基因的表达无明显下降,晚期则降低明显。4. 脑出血早期线粒体功能、结构保持在一相对正常范围,为脑出血的治疗提供了一宝贵的“时间窗”;同时,也可能与神经细胞的凋亡机制有关。……   
[关键词]:脑出血;血肿;能量代谢;线粒体功能;超微结构;呼吸控制率;琥珀酸脱氢酶;膜流动性;ATPase-6基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2003年
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