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山羊精子介导基因转移的实验研究

叶华虎

  精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer, SMGT)是以精子为载体,在受精时将外源目的基因导入卵母细胞,是目前转基因动物研究中简单而高效的方法学之一。SMGT的核心是高效、稳定的体外受精技术和精子转染技术,前者不仅有利于获得大量的胚胎来源,而且还对胚胎质量以及胚胎移植后的胎儿发育和动物个体获得有重要影响,后者是提高转基因动物成功率的关键和保证。由于国内外目前在山羊体外受精和精子转染方面的研究尚不成熟,影响了我们即将开展的以精子介导方法为基础的转基因山羊乳腺生物反应器课题进程。为此,本实验对山羊体外受精技术和精子转染技术展开研究,以建立SMGT技术平台,为转基因山羊乳腺生物反应器的研制奠定基础。本研究共分为5部分,第一、二、三部分分别就体外受精技术中的3个关键环节:卵母细胞成熟、精子获能和受精、早期胚胎体外培养进行研究,探讨体外受精影响因素,优化培养系统,建立稳定的体外胚胎生产体系。第四部分对精子供体选择、外源DNA转染精子的影响因素、精子内化转运机制以及转染方法的优化组合进行探讨,建立山羊精子高效转染方法。第五部分利用已建立的体外受精技术和精子转染技术,生产转基因胚胎,探讨精子介导基因转移的可行性、效率及稳定性。第一部分的卵母细胞成熟实验中,首先利用Hoechst33342染色检查了山羊卵巢卵泡发育特征,发现70%以上的直径>2mm卵泡卵母细胞处于GVⅡ~GVBD期,根据Hyttle的卵母细胞发育理论,这些卵已完成“获能”,是体外成熟的首选卵源;而直径<2mm卵泡卵母细胞主要处于GVⅠ期(70.8~73.1%),“获能” 过程尚未完成,体外成熟和继续发育能力有限,培养价值不高。本实验选择直径>2mm卵泡卵母细胞为卵源,比较在不同培养液中的成熟发育率,以优化成熟培养系统。发现M199+10% EGS (estrous goat serum , EGS)+ 10% GFF (goat follicles fluid, GFF)+ 15 IU/ml FSH (follicle stimulating hormone, FSH) + 30 IU/ml LH (luteinizing hormone , LH) + 1μg/ml E2 (17-β estradiol , E2)培养液中的成熟率和卵裂率最高,分别为73.1%和38%,显著高于其他培养系统;超微结构进一步证实,在该培养液中成熟的卵母细胞,结构与自然成熟卵基本一致。表明该系统不仅提高成熟率,而且促进胞质充分成熟。第二部分的精子获能实验中,主要研究了不同钙离子载体(calcium ionophre A23187,IA)浓度对精子顶体反应率和精子存活时间的影响,实验设置了0.2、0.5、0.8、1.1μmol/L 4个实验组,其中0.2μmol/L处理组的精子寿命最长,达到13 h左右,顶体反应发生率高(超过60%);受精实验结果表明,0.2μmol/L IA作用8min处理的获能精子,受精率(68.6%)和卵裂率(40%),均显著高于传统的肝素获能处理组(分别为57.8%和24.3%),超微结构进一步证实,IA处理后的精子培养5 h,67.5%的获能精子已完成顶体反应,具有正常受精能力。IA获能系统的建立,避免了肝素对精子结合外源DNA的干扰,为精子高转染方法的建立奠定了基础。第三部分的早期胚胎培养实验中,探讨了简单培养基mSOF(modified synthesis oviduct fluid, mSOF)和组织培养基M199、共培养系统以及卵裂发生时间对胚胎发育的影响。结果表明,mSOF提高卵裂率和8-cell胚胎发育率,而M199能有效支持8-cell以后的胚胎发育,共培养系统是克服胚胎体外发育阻断的有效方法。因此,本实验建立了分阶段共培养体系:即在受精后1~3天以mSOF+BSA(bovine serum albumin, BSA)+CC(cumulus cell monolayer,CC)为培养基,4~7天更换为M199+EGS+CC。在该系统培养的受精卵,2-cell、8-cell和桑胚率分别为46.5%、55.8%和40.8%;早期卵裂胚(受精后30 h内)在该培养系统中的桑胚率高达47.5%,提示分阶段共培养方法是提高山羊早期胚胎体外发育的良好体系。根据以上实验结果,我们建立了如下山羊体外受精技术体系:选择直径>2mm卵泡卵母细胞,在M199+10% EGS + 10% GFF + 15 IU/ml FSH + 30 IU/ml LH + 1μg/ml E2中培养27 h,与0.2μmol/L IA作用8min处理的获能精子共孵育12~14 h,受精卵1~3天培养于mSOF+BSA+CC,4~7天更换培养液为M199+EGS+CC。该系统具有稳定、高效等特点,卵母细胞成熟率超过70%,卵裂率为38.7%~46.3%,桑胚率40.8%~47.3%,卵裂率和桑胚率高于国内同类报道。第四部分的精子转染实验中,我们利用DIG末端标记技术和免疫组化技术研究精子转染效率。预实验发现,4只种公羊精子转染阳性率有明显差异,其中1号最低,2号最高,3、4号居中。因此,实验重点对1号和2号进行了研究,结果表明,山羊精子具有自发结合外源DNA能力,结合部位集中在精子头部核后帽区,结合的外源DNA首先“挂”在膜表面,继而被内化转运到细胞内,但并非所有的结合DNA都被内化。死精子特别是质膜破裂的死亡精子对外源DNA的结合能力显著高于质膜完整的精子(79.4%~81.1% vs 54.8%~58.6%),但死精子不能完成外源DNA的内化转运过程,DNaseⅠ消化后的阳性率低于1%。活精子的转染效率受多重因素影响,其中精浆、动物个体和精子质膜是最重要的三大因素。精浆主要抑制结合,同时也影响内化转……   
[关键词]:体外成熟;体外受精;体外获能;体外培养;精子介导基因转移;山羊
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第三军医大学2003年